Книга: Чума

3.9. Принципы лабораторной диагностики чумы

3.9. Принципы лабораторной диагностики чумы

При исследовании любого подозрительного материала применяют микроскопию, посевы на питательные среды и постановку биопроб, а для поисков больных чумной грызунов в природе и для ретроспективной диагностики чумы (в том числе у людей) (серологические методы (см. раздел 4.6). Для идентификации применяют разнообразные методы, позволяющие возможно полнее охарактеризовать выделенную культуру.

Микроскопия до сих пор не утратила своей ценности. Во время вспышек среди людей или эпизоотий он часто даёт возможность поставить предварительный диагноз по наличию в мазках биполярно окрашенных микробных клеток (рис. 6 и 7). Для этого лучше всего окрашивать мазки синью Лёффлера или краской Wayson. Очень важно, чтобы мазки готовили и фиксировали как можно быстрее после взятия материала. Иначе биполярная окраска становится менее заметной. Кстати, биполярно окрашиваются клетки не только чумного микроба, но и некоторых других грамотрицательных бактерий, например, Pasteurella multocida [Домарадский И. В., 1971], а потому при массовых исследованиях грызунов и блох на чуму нецелесообразно применять "классическую" микроскопию [Голубинский Е. П. и др., 1989].

Заслуживает внимания флюоресцентно-серологический метод, обладающий высокой чувствительностью, а подчас и специфичностью (особенно в непрямом варианте). Однако для его осуществления необходимы люминесцентный микроскоп и надлежащие диагностикумы. Последние представляют собой меченные флюоресцеин-изотиоционатом натрия кроличьи антитела к капсульному антигену чумного микроба (для прямого варианта) или немеченные антитела к капсульному антигену и меченые антикроличьи иммуноглобулины (для непрямого варианта). Как и при обычной окраске, чумной микроб выявляется в мазках, приготовленных из материала от больных, из органов животных или эктопаразитов, но только результаты при этом оценивают по яркости люминесценции. Специфичным считается свечение с яркостью в 4 или 3 "плюса".

К числу недостатков флюоресцентно-серологического метода следует отнести его ненадежность в случае атипичных штаммов. От этого недостатка A. Phillips и соавт. [1988] пытались избавиться путем замены поликлональных антител моноклональными (в прямом варианте), однако свечение оказалось очень слабым. В то же время П. И. Анисимов и соавт. [1983] утверждают, что моноклональные антитела выявляют только чумной микроб и "не реагируют в рабочем разведении с близкородственными в антигенном отношении бактериями" (даже в прямом варианте).

В настоящее время люминесцентный метод используется лишь в стационарных условиях, когда есть возможность предварительно подращивать уже изолированные культуры при температуре 37 (С, от чего метод теряет "экспрессность" и превращается в один из способов идентификации.

Исследование материала путем посевов остается основным способом диагностики чумы, но эффективность этого метода во многом зависит от качества питательных сред. Поэтому надежнее всего использовать стандартные питательные среды.

Из числа питательных сред при анализах на чуму рекомендуется применять питательный агар типа Хоттингера или Мартена, кровяной агар или агар из настоя бычьего сердца и соответствующие бульоны [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992; Bahmanyar C., Cavanaugh D. С., 1976]. Кроме того, особенно в полевых условиях, ВОЗ рекомендует дезоксихолатный агар, так как при этом не требуется стерилизации и чумной микроб может быть изолирован даже при комнатной температуре.

Для повышения "чувствительности" плотных питательных сред в качестве стимуляторов роста чумного микроба часто добавляют гемолизированную кровь и сульфит натрия, а для подавления посторонней микрофлоры (протея и некоторых других бактерий) (геницианвиолет или борную кислоту [Туманский В. М., 1958; Николаев Н. И., 1968; Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989]. Если же в исследуемом материале предполагается наличие бактериофага, могущего помешать выделению Y. pestis, то посевы производят на плотные среды с антифаговой сывороткой (2 капли сыворотки тщательно растирают по поверхности агара).

Обычно загрязненный материал (мокрота, пунктаты из бубонов, кусочки органов от трупов и грызунов и пр.) наносят на плотные среды, поскольку в жидких средах чумной микроб не выдерживает конкуренции с посторонней микрофлорой. В жидкие среды засевают только кровь, взятую с соблюдением правил асептики; при этом соотношение объема крови и бульона должно быть не менее 1:10.

Посевы инкубируют при температуре 37 (С [Bahmanyar C., Cavanaugh D. C., 1976] или 26–28 (С [Николаев Н. И., 1968; Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989] и просматривают их каждый день. При наличии чумного микроба уже через 12–14 ч. на плотных средах отмечается его рост в виде "битого стекла" и мелких, плоских, прозрачных колоний ("кружевных платочков"; через 24–48 ч. появляются оформленные колонии (рис. 8). На дезоксихолатном агаре рост становится заметным не ранее 2 сут., когда обнаруживаются мелкие, красноватые колонии. Первые признаки роста в бульоне (нежные хлопья на дне пробирки; они появляются позже, чем рост на агаре. Для выделения культуры каплю бульона растирают по поверхности плотных питательных сред.

Остановимся еще на одном из методов, который позволяет быстро, в момент выделения, отличить неполевочью разновидность чумного микроба от его "двойника" (Y. pseudotuberculosis. Для этого поверх колоний на плотную питательную среду наливают тонкий слой того же, но полужидкого (0,7 %), агара, в который предварительно вносят культуру штамма Y. pseudotuberculosis серотипа I и чашки инкубируют 24 ч. при температуре 37 (С. Отбирают колонии с первого слоя среды, вокруг которых видны четкие зоны лизиса Y. pseudotuberculosis. Необходимо однако помнить, что лизис последнего могут вызывать, помимо чумного микроба, также Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens и некоторые виды аэробных бацилл [Bahmanyar С., Cavanaugh C. D., 1976]. Подозрительные колонии отсевают для идентификации.

Поскольку нередко выделить чумной микроб путем прямого посева не удается, при исследовании больных или трупов обязательной является постановка биопроб [Николаев Н. И., 1968]. При этом для заражения лучше использовать два вида подопытных животных (морских свинок и белых мышей. Морские свинки имеют ряд преимуществ перед белыми мышами, но нечувствительны к заражению штаммами алтайского, закавказского нагорья, гиссарского или улегейского происхождения. В то же время белые мыши высокочувствительны к "мышиному" токсину и могут погибать от токсикоза еще до развития картины инфекции [Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989]. Допускается также ставить биопробы на диких грызунах, выловленных в тех же местах, где проводился забор материала, и выдержанных в лаборатории не менее 30 с., но только если они дают отрицательный результат при предварительном определении антител к FI [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992].

Способ заражения животных исследуемым материалом определяется степенью возможного загрязнения его посторонней микрофлорой. Когда материал свободен от загрязнений, например кровь больного, пунктат из невскрывшегося бубона или содержимое везикулы, пользуются методами подкожного, внутрикожного или внутрибрюшинного заражения; если же исследуют мокроту, слизь из зева, трупный материал или вытяжку из почвы, то их втирают в скарифицированную кожу морских свинок ("австрийский" метод). Иногда для повышения вероятности последующего выделения чумного микроба подкожное заражение животных комбинируют с введением эмульсии яичного желтка. В практике работы противочумных учреждений Сибири сухой желток используется с 1963 г. [Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989]. Кроме того, для этих целей можно применять гидрокортизон или холерный экзотоксин [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992].

Гибель биопробных животных наступает в разные сроки, в зависимости от содержания микробов в исследуемом материале и способов заражения. Дольше других живут морские свинки, зараженные "австрийским" способом (до 7-9-го дня), а мыши обычно погибают раньше, чем морские свинки. Так как некоторые животные иногда выживают, то рекомендуется их забивать на 7-10-й день после заражения.

Типичные для чумы патологоанатомические изменения (см. раздел 4.2) в зависимости от места инфицирования локализуются или во внутренних органах, или в подкожной клетчатке и регионарных лимфатических узлах, причём характер и интенсивность этих изменений во многом обусловливаются продолжительностью жизни животных.

В мазках-отпечатках из органов животных обнаруживается большое число биполярно окрашенных, овоидных палочек, а посевы дают обильный рост чумного микроба.

В тех случаях, когда рост возбудителя чумы в прямом посеве исследуемого материала отсутствует, а биопробные животные погибли, взвесь его органов вводят второму биопробному животному и исследование этого животного проводят так же, как и первого.

В свое время Комитет экспертов ВОЗ по чуме предложил следующие критерии для идентификации Y. pestis:

— наличие в мазках грамотрицательной, лишенной жгутиков (неподвижной) палочки с выраженной биполярной окраской;

— отсутствие спор;

— хороший рост на обычных питательных средах даже при ограничении доступа кислорода;

— ферментация глюкозы, но не сахарозы, лактозы и рамнозы (в течение 24 часов);

— положительная реакция на эскулин, но не мочевину;

— чувствительность к чумному бактериофагу при температуре 22 (С;

— патогенность для лабораторных животных (белых крыс, мышей и морских свинок) при введении любым способом в умеренных дозах.

В нашей стране рекомендуют другой набор критериев [Тинкер И. С. и др., 1970; Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989; Наумов А. В., Самойлова Л. В. 1992]:

— типичная морфология клеток в мазках;

— морфология колоний на агаре и характер роста в жидких питательных средах;

— отсутствие подвижности;

— чувствительность к псевдотуберкулёзному и чумному фагу, включая диагностический фаг Л-413;

— отсутствие газообразования и характерное изменение среды Тимофеевой-Головачёвой;

— неспособность ферментировать рамнозу и расти из малых посевных доз на беспептонном агаре;

— вирулентность для морских свинок;

— наличие капсульного антигена (FI) и Р1.

Естественно, что при идентификации культур следует учитывать и те особенности культур чумного микроба, о которых говорится в разделах 3.1 и 3.4.

Перечисленных выше критериев обычно достаточно, чтобы отличить Y. pestis от других бактерий.

Чумной микроб отличается от кокков по морфологии клеток в мазках; от бактерий кишечно-тифозной группы (биохимическими свойствами и особенностями роста на питательных средах, а также патогенностью для лабораторных животных; от листерий и эризипелотриксов (по мазкам и характеру роста, в том числе на среде Тимофеевой-Головачёвой; от возбудителя туляремии (по отсутствию роста последнего на обычных питательных средах. Не сложна также дифференциация Y. pestis от P. multocida и других пастерелл [Домарадский И. В., 1971], а также Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. ruckeri, Y. frederiksenii и Y. kristensenii. Однако сложнее дело обстоит, когда нужно бывает отличить чумной микроб от Y. pseudotuberculosis. Необходимость в этом возникает, в частности, при исследовании грызунов, объектов окружающей среды и пищевых продуктов [Сомов Г. П., Литвин В. Ю., 1988]. Эта необходимость, в первую очередь, обусловливается тем, что в ряде случаев ареалы чумы и псевдотуберкулёза перекрываются, например, во Вьетнаме [Knapp W., 1969] или Сибири [Налётова Л. Е. и др., 1984] и Средней Азии [Радченко Г. А. и др., 1984]. В подобных случаях нередко от одних и тех же грызунов одновременно выделяются Y. pestis и Y. pseudotuberculosis [Карпузиди К. С., Дрожевкина М. С., 1941; Шамова А. М., 1959; Радченко Г. А. и др., 1984]. Кроме того, нельзя исключать завоз чумы туда, где псевдотуберкулёз эндемичен. Именно так, по-видимому, обстояло дело в Санткт-Петербурге (Ленинград) в 50-х годах, когда от крыс там изолировали микроб, который в момент выделения рассматривался как Y. pseudotuberculosis. [Сомова Н. М., Сергеев Н. А., 1957], а в последующем был отнесен к виду pestis [Тимофеева Л. А. и др., 1962]. Отсутствие разлитой эпизоотии чумы в Ленинграде в этом случае можно связать с тем, что соответствующие штаммы оказались авирулентными. Напомним также, что с конца 50-х годов стала известна новая форма псевдотуберкулёза (скарлатиноподобная лихорадка, вызывающая большие вспышки на Дальнем Востоке и в некоторых других районах России [Сомов Г. П. и др., 1990], а недавно описанная и на Западе [Krober M. et al., 1983]. Мы подчёркиваем это потому, что ранее наличие вспышек можно было считать характерным для чумы, но не для псевдотуберкулёза, относящегося к неконтагиозным инфекциям. Таким образом, до некоторой степени утратил дифференциальное значение такой признак чумы, как эпидемичность.

Еще одной иллюстрацией затруднений, которые иногда встречаются на пути дифференциации Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, является случай, описанный S. Quan и соавт. [1965]. В их статье речь шла о штаммах, выделенных на Аляске от Lepus americanus. Эти штаммы были зарегистрированы ВОЗ как Y. pestis, но при тщательном изучении авторами статьи оказались Y. pseudotuberculosis. Ошибка была связана с тем, что первоначальное заключение основывалось только на результатах люминесцентно-серологического анализа.

Заметим однако, если имеют дело с неизмененными штаммами возбудителя псевдотберкулеза, то для отличия от них штаммов чумного микроба достаточно тестов указанных выше. В сомнительных же случаях дополнительную информацию можно получить на основе данных табл. 18.

Другие лабораторные методы диагностики чумы см. в разделе 4.6.