Книга: Чума

3.5. Генетика

<<< Назад
Вперед >>>

3.5. Генетика

3.5.1. Конъюгация

Поиски половой дифференциации у возбудителя чумы начались вскоре после выхода в свет книги Ф. Жакоба и Э. Вольмана [1962]. Однако очень быстро стало ясно, что собственного полового фактора типа F-плазмиды кишечной палочки ни у чумного микроба, ни у других иерсиний нет. Соответствующие данные можно найти в литературе [Домарадский И. В. и др., 1974]. Поэтому внимание исследователей быстро переключилось на изучение возможности придания иерсиниям способности к конъюгации за счёт чужеродных плазмид, обладающих Tra опероном. Тут первыми успеха добились S. Martin и F. Jacob [1962], которые сумели передать чумному микробу плазмиду F(lac Escherichia coli, получив Lac+ клоны. Позднее О. А. Проценко и П. И. Анисимов [1968, 1969] дополнили характеристику фенотипического выражения этой плазмиды в чумном микробе данными об образовании его рекомбинантами специфических пилей и об участии в гидролизе лактозы индуцибельной (как у E. coli) (-галактозидазы. Аналогичные результаты были получены на возбудителе псевдотуберкулёза. После этого начались попытки использования F(lac и F(cml штаммов обоих микроорганизмов для картирования их хромосом [Проценко О. А., 1970; Lawton W. D. et al., 1968]. Однако по ряду причин результаты не оправдали надежд и, насколько нам известно, к этому больше не возвращались, о чём можно только сожалеть. Дело в том, что в свое время в Ростовском противочумном институте был апробирован другой подход к решению указанной проблемы, основанный на принципе "специфического" мутагенеза, т. е. на получении желаемых мутантов при действии на синхронизирванные клетки специально подобранных агентов. В результате исследований удалось определить последовательность расположения на хромосоме штамма EV ряда локусов [Домарадский И. В. и др., 1974]. Впрочем у авторов не было уверенности в том, что в их опытах всегда имели место прямые, а не супрессорные мутации, и как раз в этом-то могла бы помочь разобраться конъюгация, опосредованная F-плазмидами.

Весьма примечательно, что одним из последствий приобретения чумным микробом F(-плазмид была обратимая утрата им вирулентности [Zsigray R. et al, 1983, 1985].

Вторым типом гетерологичных конъюгативных плазмид, которые переносились в клетки иерсиний и придавали им свойства доноров генетической информации, оказались R-факторы кишечной палочки [Ginosa R. S., MatneyT. S., 1963; Knapp W., Lebek G., 1967]. Однако частоты передачи различных R-факторов и экспрессии в чумном микробе соответствующих генов резистентности колебались в значительных пределах [подробнее см.? Домарадский И. В. и др.,1974].

Важно подчеркнуть, что собственных плазмид множественной лекарственной резистентности у чумного микроба нет. Одна из причин этого может заключаться в том, что чума относится к числу кровяных инфекций с трансмиссивным механизмом передачи. Именно эти два обстоятельства позволяют чумному микробу избежать контакта с основным резервуаром R-плазмид в природе (кишечными бактериями. В какой-то мере подобное объяснение подтверждается находками R-плазмид у Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica [Дроздов А. В. и др., 1992; Bechtel J., Boring J. R., 1979], заражение которыми происходит per os. Впрочем это можно объяснить и другой причиной (наличием у иерсиний мощной системы рестрикции/модификации, препятствующей проникновению в клетки чужеродной генетической информации и обусловливающей быструю её элиминацию [Cornelis G., Colson C. 1975]. Весьма вероятно, что поэтому даже у псевдотуберкулёзного микроба и возбудителя кишечных иерсиниозов R-плазмиды встречаются очень редко. Так или иначе, но открытие возможности передачи чумному микробу R-плазмид сыграло большую роль в изучении его генетики и имеет практическое значение. В частности, R-плазмиды были использованы для конструирования одного из вариантов вакцинного штамма (см. ниже), получения полирезистентнных вирулентных штаммов для испытания эффективности различных схем лечения чумы и для передачи чумному микробу от Y. pseudotuberculosis генов, ответственных за ферментацию раффинозы [Домарадский и др., а. с. СССР, № 3107970 от 14.04.81].

3.5.2. Трансформация

На основании результатов многих исследований было сделано однозначное заключение об отсутствии у чумного микроба естественной компетентности для восприятия как гомо-, так и гетерологичной ДНК. В то же время удалось показать, что у клеток чумного микроба (и других иерсиний) её можно искусственно вызывать, но только для плазмидных и фаговых ДНК. Эффективность такой трансформаци (трансфекции) достаточно велика и открывает широкие возможности для генно-инженерных манипуляций с иерсиниями. Приоритет в соответствующих разработках принадлежит автору настоящей монографии и его коллегам из ВНИИ биосинтеза белковых веществ [а. с. СССР № 2253466/0003/003 от 27.07. 78 г.; № 152324 от 19.07.79 г.; № 3047626 от 21.05.80 г. и др.], хотя об этом мало кто знает. Чтобы у читателя не возникло недоумение, предлагаем его вниманию очерки, в которых описаны причины подобной ситуации10.

3.5.3. Бактериофагия и трансдукция

Бактериофаги, лизирующие чумной микроб, многократно выделяли из фильтратов бульонных культур, от животных и блох, из почвы нор и сточных вод, причём в местах, где чумы давно не было [Pollitzer R., 1954]. В то же время, чумной микроб чувствителен к ряду фагов кишечной палочки и других бактерий. Сопоставление этих фактов вынудило Н. Н. Новосельцева и соавт. [1982] поставить вопрос: существуют ли "чумные" фаги на самом деле или приходится иметь дело с "кишечными" фагами, которые легко адаптируются к чумному микробу? Так или иначе, но фаги, пригодные для идентификации чумного микроба все же есть (например, фаги Д(Эреля, Покровской, Лариной), хотя их специфичность оставляет желать лучшего. Так, по данным Г. Г. Гурлевой [1959], помимо чумного микроба отдельные фаги, могут лизировать штаммы возбудителя псевдотуберкулёза, ряда видов кишечных бактерий и даже микрококков. В то же время чувствительность Y. pestis к чужеродным фагам при эпизоотологических обследованиях заставляет прибегать к помощи антифаговых сывороток (очевидно, они столь же неспецифичны, как и чумные фаги, которые используются для их получения).

Еще больше запутан вопрос об умеренных фагах и лизогении у чумного микроба. Некоторые авторы, например, О. П. Плотников и соавт. [1982], несмотря на возражения [Домарадский И. В. и др., 1974; Новосельцев Н. Н. и др., 1977], продолжают утверждать, что чумные умеренные фаги существуют, хотя единственным доказательством в пользу этого служат особенности морфологии негативных колоний и способность "лизогенизированных" культур продуцировать фаг. Однако постоянное образование фага присуще также псевдолизогенным культурам, что в случае Y. pestis показано Б. Н. Мишанькиным и Ю. Г. Сучковым [1973], а сама по себе морфология негативных колоний является слишком спорным признаком. В общем, мы по-прежнему придерживаемся мнения, что лизогении у чумного микроба нет, чем он отличается от Y. enterocolitica и других иерсиний [Домарадский И. В., 1971; Calvo С., Brault J., 1983].

Почти 20 лет назад я с коллегами из ВНИИ биосинтеза белковых веществ занялся поисками гетерологичных фагов для передачи генов чумному микробу, т. е. для трансдукции. Теоретическим обоснованием этого послужили данные о неабсолютой специфичности многих фагов [Амиров Э. Я., Домарадский И. В., 1981]. В конечном итоге, мы остановились на общетрансдуцирующем фаге Р1; выбор был предопределен, в частности, результатами опытов D. A. Smith и T. Burrows [1962], выявившими общие рецепторы фага Р1 у кишечной палочки и чумного микроба. Вскоре выяснилось, что фаги Р1 (Р1vir и P1сlr) пригодны для наших целей (их применение оказалось весьма эффективным средством трансдукции. С помощью фагов Р1 от кишечной палочки чумному микробу были переданы различные плазмиды, в том числе неконъюгативные или те, которые нельзя было передать с помощью конъюгации из-за явления поверхностного исключения, хромосомные гены [а. с. СССР "Метка" № 2251932/0001/001 от 15.02.1978 г.], а также фаг лямбда, маркированный транспозоном [а. с. СССР № 2269917/0005/005 от 1.09.78 г.]. Ныне предложенный нами принцип трансдукции широко применяют другие авторы, как в России, так и за рубежом.

3.5.4. Аутохтонные плазмиды

Косвенные указания на наличие собственных плазмид у чумного микроба были получены Е. Г. Кольцовой [1970], которой впервые удалась передача кишечной палочке пестициногенности от чумного микроба. Однако поиски их были заторможены утверждением R. Little и R. Brubaker [1972] о том, что чумной микроб плазмид не имеет. Тем не менее совместно с сотрудниками Кировского НИИЭГ, я все же продолжил соответствующие исследования. В моей лаборатории работали с вакцинными штаммами EV, 1 и 17, применяя для анализа ДНК электронную микроскопию, а в НИИЭГ использовали также вирулентные штаммы, а ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. В результате совместных усилий плазмиды были обнаружены. Более того, удалось установить связь патогенности (вирулентности) чумного микроба с плазмидами, что нашло отражение в формуле открытия [диплом на открытие "Плазма" № 001 от 27.06.83 г. с приоритетом от 27.12.77 г., неопубликовано]. С тех пор факт наличия плазмид у чумного микроба и их связь с вирулентностью стали непреложной истиной. Заметим, что за рубежом первые подтверждения этого стали появляться только с 1980–1981 гг.

Сейчас у чумного микроба основными считаются три плазмиды, которые кодируют свойства, указаннные в табл.14 и подробно описанные в разделе 3.8. Вместе с тем начинают появляются данные о наличии у чумного микроба других плазмид, функции которых полностью еще не вскрыты [Butler T., 1983; Tsukano H. A. et al.,1986].

Из числа основных плазмид чумного микроба постоянным атрибутом вирулентных штаммов Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis. является только одна, мол. масса которой колеблется в пределах 45–47 мДа. [Portnoy D. A., Martinez R, 1985; Skurnik M., 1985; и др.]

Все известные плазмиды чумного микроба и близкородственных иерсиний относятся к неконъюгативным. Передача их возможна только за счёт мобилизации гетерологичными конъюгативными плазмидами [Кольцова T. Г., 1970] или трандукции [собственные данные; Wolf-Watz H. et al., 1985].

Плазмидам иерсиний посвящено множество литературных источников и поэтому анализировать все относящиеся к ним данные здесь нет возможности.

<<< Назад
Вперед >>>

Генерация: 0.620. Запросов К БД/Cache: 2 / 0
Вверх Вниз