Книга: Биохимия старения

Негистоновые хромосомные белки

Белки, связанные с ДНК эукариотов и отличающиеся от гистонов, называют негистоновыми хромосомными белками (НГБ). Они были открыты в 1946 г. Мирским и Поллистером [251]. От ДНК их отделяют с помощью смеси 2 М NaCl и 5 М мочевины. К ним относятся белки, ответственные за экспрессию и репрессию генов хроматина, а также за метаболизм и модификации хромосомных белков [112]. Они имеют изоэлектрические точки от 3,7 до 9,0. Эти белки весьма неоднородны по размеру — их молекулярная масса может составлять от ~8000 до нескольких сотен тысяч. Период полужизни НГБ сильно варьирует, но в целом он много короче, чем у гистонов. Как и гистоны, они синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядра, где образуют комплексы с ДНК [366]. Если ввести НГБ в цитоплазму, они быстро проникают в ядра [378]. Клетки с более высокой метаболической активностью содержат большее количество НГБ, и этим последние отличаются от гистонов, содержание которых одинаково в клетках всех типов. НГБ присутствуют в хроматине всех тканей, но структура их в разных тканях различна как в количественном, так и в качественном отношении, т. е. эти белки ткане- и видоспецифичны. С помощью методов с высоким разрешением показано, что в каждой ткани имеются сотни типов НГБ. В глиальных клетках с помощью изоэлектрофокусирования и микродиск-электрофореза было обнаружено почти 1500 НГБ [211]. По всей вероятности, некоторые из них представляют собой модифицированные НГБ, причем они синтезируются в течение всего клеточного цикла, тогда как гистоны синтезируются только в S-фазе.

После обработки хроматина тимуса теленка 0,3 М NaCl НГБ по подвижности в геле делятся на две группы: высокоподвижная группа (HMG, от англ. high mobility group) с мол. массой менее 30000 и малоподвижная группа с мол. массой более 30000 [176–178]. К HMG-белкам относятся четыре белка с большим зарядом: HMG₁ HMG₂, HMG₁₄ и HMG₁₇. Они включают 25 % основных и 30 % кислотных остатков и составляют только 3 % веса ДНК; они присутствуют во всех тканях и не являются тканеспецифичными [297]. Белки HMG ассоциированы с нуклеосомой [134]. Белки HMG₁ и HMG₂ имеют мол. массу около 26000. Они взаимодействуют с ДНК своими основными остатками [382, 383]. Около 50 % остатков HMG₁ заряжены. Необычным является то, что его COOH-концевая область содержит последовательность из 41 чередующихся остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Каждое ядро из тимуса теленка содержит ~10⁶ молекул белков HMG₁ [59, 361]. По-видимому, белки HMG играют в хроматине структурную, а не регуляторную роль. Белок HMG₁ в отличие от трех остальных не содержит ароматических аминокислот. Он включает последовательность из 89 остатков и имеет мол. массу 9247. Его карбоксильный конец представляет собой цепь кислотных остатков, а NH₂-конец — цепь основных остатков; центральная область богата остатками лизина. HMG₁₇ не имеет вторичной и третичной структуры, а по последовательности входящих в него аминокислотных остатков он гомологичен гистонам Н1 и Н5. Его уникальная первичная структура с цепями кислотных и основных остатков указывает на то, что он может быть структурным белком. Показано, что белок HMG₁₇ связывается приблизительно с 57 нуклеотидами ДНК из тимуса теленка и вызывает конформационные изменения в ДНК, сходные с теми, которые производит гистон Н1 [174], причем с ДНК связываются остатки с 15 по 40 [1].

Поскольку белки HMG имеют кислотные и основные остатки, образующие кластеры, они могут связываться с гистонами. своими кислотными группами, а с ДНК — основными остатками. Белки HMG₁ и HMG₂ ассоциированы с нуклеосомой [29]. Они стабилизируют двойную спираль ДНК, поскольку при ассоциации с ними ее Т_m увеличивается на 20 °C [382, 383]. Таким образом, имеются достаточные основания полагать, что белки HMG играют в хроматине структурную роль. При воздействии ДНКазы I на активную часть хроматина белки HMG удаляются. По-видимому, эти белки связаны с нуклеосомами [326]. Дефер и др. [98] также сообщают, что НГБ связаны с нуклеосомами. Существуют экспериментальные доказательства структурной роли некоторых НГБ [7, 8]. Метафазные хромосомы клеток HeLa сохраняют свою морфологию даже после того, как удалены все гистоны и большинство НГБ. Структура поддерживается лишь с помощью ~30 % НГБ, причем в их число входит около 30 типов НГБ с мол. массой ~75000. Каждая хроматида находится в спаренном состоянии, как в метафазе, и остается стабильной даже в 2 М NaCl. Установлено также, что после удаления гистонов из метафазных хромосом их общий размер уменьшается на 50 %, и это не приводит к заметным нарушениям в их морфологии [175]. Отсюда следует, что НГБ ответственны за поддержание метафазной структуры хромосом, а, возможно, также и структур других фаз клеточного цикла. Есть сообщения [44, 265], что НГБ участвуют в процессе закручивания ДНК в сверхспираль и в образовании структуры хроматина высшего порядка. В связи с этим было высказано предположение, что НГБ образуют "строительные леса", или каркас, определяя таким образом основную форму метафазной хромосомы, и в соответствии с этим каркасом ДНК сворачивается в петли.

НГБ очень неоднородны, число их велико, и некоторые из них ткане- и видоспецифичны. Общее содержание НГБ в разных тканях соответствует следующему ряду: мозг>печень>>почки>>селезенка>тимус [255]. Некоторые НГБ специфичны для каждой ткани, а относительные количества индивидуальных НГБ варьируют от ткани к ткани. Они претерпевают количественные и качественные изменения при различных физиологических условиях, а также в процессе эмбриогенеза, дифференцировки клеток и клеточного цикла. Некоторые НГБ слабо связаны с ДНК и легко экстрагируются, другие связаны сильнее. Благодаря своим свойствам они участвуют в регуляции экспрессии генов в целом [202, 285, 325, 332, 347] и в контроле транскрипции в частности [27, 186, 193]. Показано [347], что фракция НГБ из печени крысы стимулирует транскрипцию in vitro. Когда НГБ добавляют к хроматину эмбриона морского ежа, увеличивается число участков инициации синтеза РНК [245]. Аналогичные наблюдения сделаны на клетках асцитного рака Эрлиха: фракция слабо связанных НГБ избирательно ассоциирует с гомологичной ДНК и стимулирует транскрипцию специфических структурных генов в присутствии РНК-полимеразы эукариот [202, 203]. Удалось идентифицировать [203] фосфорилированный НГБ с мол. массой 11000, который ингибирует инициацию транскрипции и играет регуляторную роль в экспрессии генов. Сообщалось также об участии в регуляции специфической активности генов сильно связанных НГБ [40, 82]. Катино и др. [73] изолировали НГБ с мол. массой 31000, который в большом количестве содержится в неделящихся клетках, но в малом количестве — в делящихся, как, например, в гепатоме Новикова. Когда НГБ выделяли из хроматина с помощью 5 М мочевины (М₀), смеси 5 М мочевины и 1 М NaCl (M₁) и смеси 5 М мочевины и 3 М NaCl (M₃) и изучали роль каждой полученной фракции в транскрипции комплекса ДНК — гистон из печени кролика, оказалось, что функции этих трех фракций различны [30]. Фракция М₀ стимулирует транскрипцию, связываясь с хроматином и изменяя общую конформацию комплекса ДНК — гистон. Фракция М₃ связывается более специфическим образом и раскрывает новые центры для связывания РНК-полимеразы. Фракция M₁ включает, по-видимому, структурные компоненты хроматина.

Метаболически более активные клетки содержат большее число НГБ. Обычно НГБ локализованы в тех областях хроматина, которые более активны в процессе синтеза РНК [90, 376]. НГБ способны прекращать репрессию матричной активности, вызываемую гистонами [110, 319]. Некоторые фосфорилированные НГБ специфически взаимодействуют с гистонами Н1 и Н2В и поэтому могут удалять их и открывать участки ДНК для транскрипции [247]. НГБ способны переводить неактивные покоящиеся клетки, находящиеся в фазе G₀, в активно растущие в стадии G₁. В процессе этого перехода происходит синтез специфических типов НГБ и одновременно увеличивается матричная активность [158, 222, 305]. Отсюда был сделан вывод, что эти белки участвуют в дерепрессии или в положительной регуляции экспрессии генов, особенно в контроле транскрипции в течение клеточного цикла.

При введении цыпленку эстрадиола или прогестерона синтез НГБ в яйцеводе стимулируется. НГБ в яйцеводе крыс, принимавших гормональные препараты, качественно отличны от белков контрольных животных [156]. Полагают, что в ядре акцептором для прогестерон-рецепторного комплекса является НГБ. Глюкокортикоид-рецепторный комплекс лучше связывается с хроматином печени, чем с хроматином тимуса, простаты и матки. Если из хроматина удалить гистоны, то в оставшемся хроматине связывание комплекса увеличивается вдвое. Если же удалить все хромосомные белки, то связывание рецепторного комплекса глюкокортикоида с ДНК уменьшается на 50 %. Отсюда следует, что НГБ ответственны за связывание рецепторного комплекса гормона с ДНК [151]. Синтез НГБ стимулируется кортизоном [14] и глюкагоном [113]. Стероидные гормоны, индуцирующие фосфорилирование НГБ в яйцеводе [88], а также кальцитонин и гормоны паращитовидной железы, которые оказывают противоположное действие на метаболизм кальция в костных клетках, стимулируют фосфорилирование различных НГБ [60].

Экдизон — стероидный гормон, ответственный за развитие насекомых — вызывает образование пуффов в хромосомах слюнных желез у личинок Sciara [133]. Возникновение пуффа указывает на то, что в данном участке происходит транскрипция. В месте пуффа, вызванного действием экдизона, не наблюдается увеличения содержания гистонов или ДНК, в то время как содержание НГБ почти удваивается. Пуффы образуются лишь после окончания определенной стадии развития, когда клетки становятся компетентными (17-дневные личинки); они не появляются у 4-дневных личинок. Это свидетельствует о том, что для действия экдизона необходим какой-то цитоплазматический фактор, вероятно белок. Следовательно, прежде чем экдизон сможет оказать воздействие на специфические гены, должен быть активирован определенный ген, ответственный за синтез этого белка. При возникновении пуффов в политенных хромосомах Drosophila отношение белков к ДНК увеличивается с 6 до 16, количество РНК увеличивается вдвое, а Т_m данного участка понижается на 10 °C [281]. Кроме того, около пуффов накапливаются НГБ. В содержании ДНК и гистонов, связан дается никаких изменений, а большая часть гистонов, связанных с ДНК, оказывается дестабилизированной. Эти наблюдения подтверждаются результатами, полученными с помощью иммунофлуоресценции, согласно которым пуффы, индуцированные в политенных хромосомах Drosophila тепловым ударом, содержат новые НГБ. Очевидно, НГБ ответственны за активацию генов.

Воздействие НГБ на экспрессию специфических генов изучалось рядом исследователей [173, 284, 351]. Когда НГБ клеток HeLa добавляли к хроматину этих клеток в фазе G₁, начиналась транскрипция генов гистонов, хотя обычно в этой фазе их экспрессии нет. При воссоединении хроматина в S-фазе клеток W1-38 с S-фазными НГБ наблюдается 500-кратная стимуляция транскрипции генов гистонов, в то же время при воссоединении хроматина печени мыши с S-фазными НГБ клеток HeLa транскрипции генов глобина не происходит. Эксперименты по реконструкции с использованием хроматина эритроцитов цыпленка показали: для того чтобы вызвать транскрипцию генов глобина, определенная фракция НГБ должна связываться с ДНК раньше, чем с гистоном [124]. После того как удалось разделить хроматин клеток тимуса теленка и костного мозга на ДНК, гистоны и НГБ, полученные компоненты были использованы в опытах по реконструкции [131]. Оказалось, что в случае клеток тимуса синтезированные РНК похожи на РНК тимуса, а мРНК глобина не синтезируются. Когда же был реконструирован и использован для транскрипции хроматин костного мозга, мРНК глобина синтезировались. Вместе с тем если в реконструкции участвовали ДНК и гистон тимуса и НГБ костного мозга, то также происходил синтез мРНК глобина. Отсюда следует, что НГБ, вероятно, участвуют в регуляции специфических генов. В культуре клеток мышц НГБ активно фосфорилируются главным образом во время дифференцировки [221]. Установлено также, что НГБ принимают участие в положительном контроле экспрессии генов. Однако для того, чтобы идентифицировать специфические компоненты НГБ, участвующих в контроле, и установить точный механизм контроля, необходимы дальнейшие исследования.