—————

Кишечная микрофлора превращает человека в «сверхорганизм». В молекулярно-биологических исследованиях главный залог успеха — это удачный выбор объекта и методики. Новые эффективные методы, разработанные для решения конкретных задач, могут вдруг оказаться весьма полезными и в совершенно других областях. Именно это и произошло в данном случае. Американские биологи нашли необычное применение новейшим методикам, разработанным для «прочтения» геномов различных организмов. Ученые применили эти методы к ДНК, экстрагированной из человеческих фекалий, с целью получения общей характеристики кишечной микрофлоры.

По имеющимся оценкам, в кишечнике взрослого человека присутствует более 1 кг микроорганизмов, относящихся к сотням различных видов. В точности их видовой состав неизвестен. Микробиологи знают «в лицо» лишь несколько десятков типичных представителей, которых можно вырастить на искусственных средах. Как выяснилось сравнительно недавно (и это открытие стало шоком для микробиологов), большинство существующих в природе микроорганизмов на искусственных средах не растет. Таких микробов называют некультивируемыми. В человеческом кишечнике они тоже, скорее всего, составляют большинство. Что-либо узнать об этих микробах удается лишь по нуклеотидным последовательностям ДНК в пробах, взятых из естественных сред.

Исследователи выделили ДНК из фекалий двух человек, не принимавших целый год перед этим никаких лекарств, и провели масштабную работу по секвенированию — определению нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК. Отсеквенированные кусочки затем собирались в более длинные фрагменты на основе наличия перекрывающихся участков. В итоге получилось около 74 тысяч неповторяющихся кусков общей длиной свыше 78 млн пар нуклеотидов. Для сравнения — в геноме человека свыше 3 млрд пар нуклеотидов, в геноме одной бактерии обычно 2–5 млн п.н.

Разумеется, исследователи не рассчитывали получить полные геномы всех кишечных микробов. Для этого им пришлось бы приложить на несколько порядков больше усилий. Они лишь хотели получить общее представление о разнообразии микробного сообщества, его структуре и, главное, обмене веществ. А для этого полученной выборки геномных последовательностей оказалось вполне достаточно.

Такой радикальный подход к изучению сообществ — свалить всех в одну кучу, истолочь и отсеквенировать — получил даже специальное название — метагеномный анализ.

—————

Метагеномный анализ применяется в тех случаях, когда требуется выяснить, какие микроорганизмы присутствуют в пробе. Суть метода в тотальном выделении из образца (например, из морской воды, почвы, тканей какого-нибудь животного или из содержимого кишечника) всех молекул ДНК, какие попадутся. ДНК секвенируют (определяют последовательности нуклеотидов) и по этим последовательностям выясняют, какие существа присутствуют в пробе. Важное достоинство такого подхода в том, что он позволяет обнаружить и охарактеризовать микробов, не поддающихся культивированию в лаборатории (а таких среди микробов большинство). Генетические базы данных сегодня уже достаточно представительны, чтобы по набору выделенных из пробы генов можно было определить, какие организмы присутствуют в пробе, даже если эти организмы до сих пор не были известны науке. Сравнивая найденные гены с известными, можно выяснить не только чьими родственниками являются эти существа, но и как они живут и чем дышат.

—————

На следующем этапе в отсеквенированных последовательностях искали гены с известными функциями и пытались определить, какие фрагменты принадлежат бактериям, а какие — археям. Для этого последовательности сравнивались с известными, то есть внесенными в базы данных генами бактерий и архей, а также с их полными геномами. Отдельно анализировались гены рибосомной РНК (16S), по которым традиционно проводят классификацию микробов.

В «явном виде» по генам рибосомной РНК удалось идентифицировать лишь 72 разновидности бактерий (из них 60 некультивируемых и 16 новых для науки) и один вид архей-метаногенов, однако авторы обосновали статистически, что, если бы работа по секвенированию ДНК из тех же самых проб была продолжена, число выявленных разновидностей микробов составило бы не менее 300.

Оказалось, что в кишечной микрофлоре резко повышена доля генов, имеющих отношение к метаболизму полисахаридов растительного происхождения, некоторых аминокислот и витаминов, а также к метаногенезу. На основе проведенного анализа авторы выделили наиболее важные метаболические функции, которые выполняют микробы в человеческом кишечнике. Это прежде всего переваривание растительных полисахаридов, которые не могут перевариваться ферментами, закодированными в геноме человека. С этими трудноусваиваемыми углеводами расправляются в основном бактерии-бродильщики, выделяющие в качестве конечных продуктов обмена низкомолекулярные органические кислоты. Однако то, что для бактерий-бродильщиков является отходами жизнедеятельности, для человека — вполне съедобные вещества, которые активно всасываются кишечным эпителием. По имеющимся оценкам, из этого необычного источника люди получают около 10% калорий (эта оценка справедлива для приверженцев типичной «европейской» диеты). Задумайтесь, что это значит: не бактерии питаются нашими отходами, как кто-то мог бы подумать, а как раз наоборот!

Кроме съедобных для человека веществ бактерии-бродильщики выделяют в качестве побочного продукта еще и молекулярный водород (H₂), который вреден для них самих и препятствует их росту и жизнедеятельности. Чтобы процесс переваривания растительных полисахаридов шел эффективно, кто-то должен постоянно утилизировать образующийся водород. Именно этим и занимаются археи-метаногены. В ходе метаногенеза поглощаются водород и углекислый газ и выделяется метан.

В «совокупном геноме» кишечной флоры сильно повышено процентное содержание генов, связанных с синтезом незаменимых аминокислот и витаминов. Микробы сильно облегчают человеку жизнь, производя значительные количества этих необходимых нам веществ. Кроме того, кишечная флора располагает большим арсеналом ферментов для обезвреживания токсичных веществ, присутствующих в нашей повседневной пище, особенно растительной.

Микробные геномы, таким образом, служат важным дополнением к геному Homo sapiens. Хоть это и нехарактерно для публикуемых в наши дни на Западе научных работ, авторы в данном случае решились на философское обобщение. По их мнению, человека следует рассматривать как «сверхорганизм», чей обмен веществ обеспечивается совместной слаженной работой ферментов, закодированных не только в геноме Homo sapiens, но и в геномах сотен видов симбиотических микробов. Между прочим, доля человеческих генов в совокупном геноме этого «сверхорганизма» составляет не более 1%.

(Источник: Steven R. Gill et al. Metagenomic Analysis of the Human Distal Gut Microbiome // Science. 2006. V. 312. P. 1355–1359.)

—————

—————

Выход растений на сушу — результат симбиоза. Первые наземные растения появились в конце силурийского периода (более 400 млн лет назад). Недавно палеонтологи обнаружили, что уже самые первые наземные растения жили в симбиозе с грибами: у них была самая настоящая микориза. У этих растений еще не было настоящих корней — вместо них имелись так называемые ризоиды, не способные самостоятельно всасывать что-либо из почвы и служившие только для закрепления в грунте, а также, как теперь выяснилось, для обеспечения симбиоза с почвенными грибами. По- видимому, без этого симбиоза растения вообще не смогли бы выйти на сушу. Симбиоз растений с азотфиксирующими бактериями возник позже, причем для этого растениям оказалось достаточно лишь немного изменить те генетические системы, которые сложились у них ранее для взаимодействия с микоризными грибами.

—————

—————

Способность тлей приспосабливаться к колебаниям температуры зависит от симбиотических бактерий. Тли питаются исключительно соками растений. Жить на этой скудной диете им позволяет удачный симбиоз с бактериями Buchnera. Симбионты получают от хозяев кров и пропитание, а в обмен синтезируют для них аминокислоты, витамины и другие вещества, напрочь отсутствующие в той чуть сладенькой водичке, которая составляет единственную пищу тлей.

То, что тли представляют собой в действительности симбиотические «сверхорганизмы», придает довольно своеобразный характер их экологии и эволюции. Например, у тлей вполне возможно наследование благоприобретенных признаков «по Ламарку». Ведь за жизнь одной тли в ее клетках сменяется несколько поколений симбионтов-бухнер, при этом генофонд бактерий может измениться в результате мутаций и отбора, и тогда тля передаст своим потомкам симбионтов, генетически отличных от тех, что она сама получила от матери (см. главу «Наследуются ли приобретенные признаки?»).

Недавно сотрудники Факультета экологии и эволюционной биологии Аризонского университета в Тусоне (США) обнаружили, что генетические особенности симбионтов могут сильнейшим образом сказываться на жизнеспособности и экологических характеристиках всего симбиотического комплекса.

Симбиозу тлей с бухнерами уже более 100 миллионов лет. За это время бухнера подверглась генетической деградации — это почти неизбежная судьба всех внутриклеточных симбионтов (конечным этапом деградации, как мы знаем, может стать превращение бактерии в клеточную органеллу). Бухнера потеряла способность к рекомбинации (обмену генами с другими бактериями), ее геном сильно сократился, упростился и потерял пластичность из-за утраты мобильных генетических элементов и повторов. Это снизило приспособительные способности бактерии. Как любой организм, привыкший к относительно неизменным благоприятным условиям, бухнера стала ужасно изнеженным и капризным существом. А это, в свою очередь, накладывает ограничения на весь «сверхорганизм». Например, бухнеры не любят жары — и это сильно мешает тлям распространяться в тех регионах, где высока вероятность перегрева. Между прочим, ограничения такого рода характерны и для многих других сверхорганизмов: мелкие наземные позвоночные не могли как следует освоить растительную диету, пока не выработали теплокровность (необходимая для переваривания клетчатки кишечная флора не выносит охлаждения); вспомним также, какие усилия прикладывают для поддержания постоянной температуры в своих жилищах термиты.

Компоненты симбиотического сверхорганизма: тля (справа) и бактерии Buchnera, живущие в специализированных клетках хозяина — бактериоцитах.

Главная проблема, с которой организм сталкивается при перегреве, — это возможность денатурации (необратимого изменения структуры) некоторых белков. Обычно клетка в ответ на повышение температуры включает ряд генов (их называют генами теплового шока), кодирующих специальные белки — шапероны, чья функция состоит втом, что они «насильно» придают другим белкам правильную конфигурацию (см. сюжет «Когда вредных мутаций много, они не так вредны» в главе «Управляемые мутации»). Гены теплового шока (в количестве пяти штук) есть и у бухнеры.

Любопытно, что некоторые гены, которые у других организмов обычно активируются при перегреве, у бухнеры всегда работают с повышенной активностью. Дело в том, что неправильное сворачивание белков может происходить не только из-за высоких температур, но и из-за вредных мутаций в генах, кодирующих эти белки. Бухнера, лишенная способности к рекомбинации, обречена на постоянное накопление мутационного груза, а шапероны до некоторой степени могут сгладить негативные эффекты мутаций, сворачивая правильным образом не совсем правильные белки.

Ученые взяли три лабораторные линии гороховой тли Acyrthosiphon pisum и измерили активность генов бухнеры[38] при нормальной температуре и при перегреве. Оказалось, что у бухнер одной из трех линий при тепловом шоке не активируется ген ibpA, который кодирует небольшой «теплозащитный» белок, имеющийся не только у бактерий, но и практически у всех живых организмов.

Поскольку линия тлей, где обнаружилась эта аномалия, была произведена всего пять лет назад от «нормальной» линии, в которой ibpA активируется при перегреве, ученые предположили, что причиной является мутация, возникшая менее пяти лет назад.

Геном бухнеры прочтен, и найти мутацию было нетрудно. Исследователи отсеквенировали (определили нуклеотидную последовательность) регуляторной области гена ibpA и обнаружили, что у бактерий с аномальной реакцией на перегрев «потерялся» один нуклеотид (аденин) в том месте, где к хромосоме присоединяется регуляторный белок y32, который как раз и включает ген ibpA (и другие гены теплового шока) в стрессовой ситуации.

В дальнейшем были проверены многие другие лабораторные линии тлей этого вида, и в одной из них обнаружился второй случай независимого возникновения той же самой мутации. Зная историю изучаемых линий, авторы установили, что один раз мутация произошла в 2001 году, второй — в 2005-м. Естественно, ученые захотели выяснить, встречается ли эта мутация в природных популяциях. Оказалось, что она довольно обычна у тлей из прохладных штатов Нью-Йорк и Висконсин (в некоторых популяциях мутантные симбионты присутствуют у 20% тлей), но не встречается в штатах Аризона и Юта, где бывает по-настоящему жарко.

Эксперименты подтвердили, что у всех мутантов ген ibpA не активируется при перегреве, а у всех линий без мутации — активируется. Остальные гены теплового шока активировались совершенно одинаково как у мутантных, так и у нормальных бухнер.

Исследователи решили выяснить, каким образом мутация, произошедшая у бактериального симбионта, отражается на жизнеспособности и репродуктивном потенциале симбиотического сверхорганизма. Тлей с мутантными и нормальными бухнерами выращивали в разных температурных условиях: при постоянной температуре 15 и 20 °C, а часть насекомых в возрасте двух дней после вылупления из яйца подвергали четырехчасовому нагреванию до 35,5 °C. Выяснилось, что после перегрева тли с мутантными симбионтами почти полностью утрачивают способность к размножению, тогда как тли с нормальными симбионтами размножаются вполне успешно. Однако при постоянной температуре 15 или 20 °C заметным преимуществом обладают тли с мутантными симбионтами. Они раньше начинают размножаться и в среднем производят больше потомков.

Дополнительные эксперименты позволили установить, почему кратковременный перегрев так губительно сказывается на тлях с мутантными бухнерами: повышение температуры до 35 °C или выше приводит к массовой гибели бактериальных симбионтов. После этого остается всего лишь около 1000 бактерий на одно насекомое, тогда как норма составляет примерно миллион.

Таким образом, мутантные бухнеры дают преимущество тлям при постоянной невысокой температуре среды, а «нормальные» выгодны в том случае, если существует опасность перегрева. По-видимому, в зависимости от климатических условий местности и даже от времени года направление отбора в природных популяциях тлей может меняться: иногда преимущество получают тли с обычными, а иногда — с мутантными симбионтами. В результате оба генетических варианта сохраняются в природных популяциях, и ни один из них не может полностью вытеснить другой.

(Источник: H. E. Dunbar, A. C. C. Wilson, N. R. Ferguson, N. A. Moran. Aphid Thermal Tolerance Is Governed by a Point Mutation in Bacterial Symbionts // PLoS Biol. 2007. 5(5): e96.)

—————