Книга: Что, если Ламарк прав? Иммуногенетика и эволюция

«Печать» соматических мутаций и отбора стоит на всех V-генах зародышевой линии

«Печать» соматических мутаций и отбора стоит на всех V-генах зародышевой линии

Наш интерес к анализу ДНК-последовательностей V-генов зародышевой линии начался с наблюдений нашего коллеги Гарри Ротенфлу. В 1992 г, выполняя свою диссертационную работу, он изолировал и секвенировал V-элементы зародышевой линии из Ig-локуса тяжелой цепи мыши (различие между «конфигурацией зародышевой линии» и «соматической конфигурацией» V-генов описано в гл. 4). Напомним, что перестроенные V(D)J-гены вариабельной области появляются только в зрелых В-клетках, и эти гены являются непосредственными мишенями антигензависимых процессов — соматического мутирова-ния и отбора в центре размножения. Данные Гарри Ротенфлу показали, что особенности ДНК-последовательностей соматической конфигурации свойственны и конфигурации зародышевой линии!

Такое строение ДНК-последовательностей V-генов в зародышевой линии трудно объяснить в рамках любой теории, опирающейся на полное запрещение переноса генетической информации от сомы к зародышевой линии. Во-первьгх, V-элементы половых клеток никогда не могли быть прямой мишенью для естественного отбора (т. е. связывания антигена). Отбору подвергается только полностью собранный белок антитела (H+L гетеродимер) на поверхности В-лимфоцита, и только он проходит проверку на антигенсвязывающую функцию. Сами по себе V-элементы клеток зародышевой линии никогда не превращаются в РНК (не транскрибируются) или в белок (не транслируются). Они экспрессируются в зрелом В-лимфоците только после перемещения ДНК в хромосоме соматической клетки, приводящего к созданию типичного перестроенного V(D)J-участка (рис. 4.5). Функциональные исследования обнаружили, что только половина репертуара V-генов зародышевой линии появляется в V(D)J-последовательностях. Многие, возможно, никогда не использовались в зрелых V(D)J-перестройках и, по-видимому, никогда не подвергались отбору.

Во-вторых, геном мыши и человека содержит много V-генов зародышевой линии (примерно по 100 для Н- и L-цепей). И хотя их последовательности в каждой из групп (Н или L) высоко гомологичны, но есть и довольно заметные различия. Изменчивость V-элементов зародышевой линии и для Н-, и для L-цепей характеризуется кривой Ву—Кэбота, т. е. высоко неслучайна (рис. 5.3). В предыдущей главе мы уже рассказали, что такая картина неслучайной изменчивости создается только прямым антигенсвязывающим отбором, действующим на молекулу антитела, расположенную на поверхности В-лимфоцита. Этот вопрос обсуждался в предыдущей главе.

В-третьих, V-гены зародышевой линии мыши и человека «не затронуты» стоп-кодонами. Другими словами, многие V-гены зародышевой линии являются «открытыми рамками считывания». Обнаруживается статистически значимое снижение наблюдаемой частоты стоп-кодонов внутри кодирующих участков V-генов по сравнению с ожидаемой на основании процесса случайных мутаций. Это относится и к так называемым V-псевдогенам — нефункциональным V-генам, которые не могут экспрессироваться как мРНК и белок вследствие мутационных повреждений, нарушивших рамку считывания кодирующего участка или изменивших регуляторную последовательность. Считается, что такие поврежденные гены накапливают мутации, так как они не могут подвергаться действию отбора. Итак, низкая встречаемость точковых мутаций (или мутаций «сдвига рамки» из-за вставок или потерь оснований), приводящих к появлению стоп-кодона и в функциональных генах, и в псевдогенах предполагает существование механизма, который направлен на поддержание «открытой рамки считывания» V-генов зародышевой линии. Однако открытая рамка считывания может подвергаться отбору только на уровне связывания антигеном, связывания интактного гетеродимера, расположенного на поверхности клетки, и антигена.

Таким образом, структура ДНК-последовательности V-генов зародышевой линии млекопитающих предлагает нам сложную загадку. Согласно модели случайного дрейфа, эти гены должны накапливать довольно большое число фоновьк мутаций. Поскольку этого не происходит, то следовательно, эти последовательности несут следы отбора на уровне белка. Указанные особенности последовательностей V-генов наблюдаются у всех изученных до сих пор позвоночных, от хрящевых рыб, амфибий (лягушки) до кроликов, овец, мышей и человека.

Противоречия станут еще глубже, если рассмотреть ДНК-последовательности V-генов зародышевой линии у кур, изученные французскими и американскими исследователями под руководством Жан-Клода Вейля (Weill) и Крейга Томпсона (Thompson) в течение последних 10 лет. У кур процесс образования антител несколько отличается от такового у мышей и человека. Первое отличие заключается в том, что локусы тяжелой и легкой цепей содержат только по одному функциональному V-элементу, включающему сигнальную последовательность для активирующего рекомбинацию генов фермента (RAG), который обеспечивает перестройку ДНК. Вверх (к 5' концу) от этого функционального V-гена находится 20—100 псевдогенов. Они в основном нефункциональны из-за того, что у них укорочен участок, контролирующий транскрипцию (промотор), который может тянуться до последовательности, кодирующей лидерньш пептид (L). У них также отсутствует и сигнальная последовательность для RAG-фермента. Эти псевдогены тесно упакованы в ДНК зародышевой линии, по краям каждого кодирующего участка расположено всего несколько сот (самое большое) оснований. В отличие от них V-элементы генов зародышевой линии у человека и мыши отделены друг от друга 10—20 килобазами ДНК. Таким образом, размер IgV локусов курицы составляет примерно 1/20 размера этих локусов мыши и человека.

В развивающихся куриных В-лимфоцитах происходит перестройка единственного интактного V-гена и образование функционального вариабельного V(D)J-гена. Затем к нему добавляются фрагменты разной длины (5—100 оснований) расположенных выше V-псевдогенов. Этот процесс называют генной конверсией. Разные результаты генной конверсии в разных В-клетках приводят к образованию большого репертуара V(D)J-последовательностей. Такой источник разнообразия функциональных антител так же эффективен, как у мышей и человека, но требует гораздо меньшего (1/20) количества ДНК зародышевой линии.

Но самое поразительное в строении V-псевдогенов это то, что если сравнить их ДНК-последовательности с помощью компьютерных программ, то обнаруживается структура By— Кэбота»! (рис. 6.2). Более того, если различия между псевдогенами обусловлены вставкой и потерей нуклеотидов в кодирующих участках, они всегда кратны трем (т. е. триплету); таким образом, сохраняется правильная трансляционная рамка считывания! Это показано на рис. 6.2. Напомним, что триплетный ко-дон определяет аминокислоту в цепочке белка (см. приложение). Вдобавок у кур псевдогены тяжелой цепи на 3'-(правом) конце несут короткую D-последовательность (и все они находятся в предпочтительной рамке считывания, наблюдаемой только в соматически экспрессирующихся V(D)J-последовательностях). Псевдогены как тяжелых, так и легких цепей отличают вставки или потери нуклеотидов, которые, как известно, происходят в В-лимфоцитах при образовании V(D)J-пepeстройки. Эти вставки и потери создают третий гипервариабельный участок! Такие действительно поразительные и необычные свойства обнаружены в ДНК зародышевой линии, кодирующей псевдогены. Она несет «печать» соматических событий.

Рис. 6.2. Вариабельность ДНК и аминокислот (Ву-Кэбот) V-псевдогенов зародышевой линии у кур. Графики Ву—Кэбота для вариабельных областей псевдогенов 18 тяжелых {А)и 25 легких (Б) цепей генома кур. И для тяжелых, и для легких цепей наблюдаются неслучайные структуры Ву—Кэбота, свидетельствующие об антигенсвязывающем отборе В-клеток на уровне белка Ig. Этот результат противоречит структуре их последовательностей, которая гарантирует, что сами по себе эти гены никогда не экспрессируются как белковая последовательность.Верхние графики показывают вариабельность нуклеотидов в ДНК-последовательностях по длине участка, а нижние — вариабельность аминокислот (после трансляции успешной ДНК-последовательности триплетных кодонов в аминокислотную последовательность, см. приложение). Первое основание или аминокислота предполагаемого кодирующего участка обозначено как положение 0. Обратите внимание, что гипервариабельные последовательности совпадают с антигенсвязывающим центром (CDR), такая картина графика Ву—Кэбота ожидается для функционального белка вариабельной области (рис. 5.3). Положения, в которых произошли вставки (+) или потери (-) триплетов оснований обозначены светлыми стрелками. Относительные положения CDR1, CDR2 и CDR3 показаны на диаграммах под графиками. Появление вставок или потерь оснований наборами триплетных кодонов в правильной рамке считывания (см. приложение) снова свидетельствует об антигензависимом отборе, действующем на уровне белка — что невозможно, так как эти гены — псевдогены! Разумное объяснение таково, что эти последовательности оснований в V-псевдогенах зародышевой линии поддерживаются как открытые рамки считывания обратной связью сомы и зародышевой линии функциональных V(D)J-последовательностей после направляемого антигеном соматического отбора. (По Rothenfluh H. S., Blanden R. V., Steele E. J. Immuno-genetics,vol. 42: 159-171, 1995 с разрешения издателя, Springer-Verlag Gmbh &Co. Kg.)

Следовательно, куриные псевдогены — это чудовищный вызов традиционной молекулярной генетике, основанной на строгой неодарвинистской парадигме. Парадоксально, у них проявляются все черты прямого антигенсвязывающего отбора на уровне антитела, хотя ДНК-последовательности, характерные для зародышевой линии, транскрибируются (в мРНК) и транслируются (мРНК в белок) только по частям, после процесса соматической генной конверсии. Такая структура ДНК-последовательностей разумно объясняется только генетической моделью отбора антигеном соматического V(D)J-гена и последующей обратной связи генов вариабельной области сомы и зародышевой линии (наиболее вероятно, через РНК-> ДНК-копирование, или обратную транскрипцию). См. рис. 6.3 и рис. 1.2.

Структура Ву—Кэбота и другие соматические черты V-генов и псевдогенов зародышевой линии позвоночных (особенно поразительные свойства псевдогенов кур, описанные выше) указывают на действие процесса обратной связи генов сомы и зародышевой линии, активного в течение 400—500 миллионов лет эволюции V-генов. Следовательно, сейчас у нас есть причины для введения в современную эволюционную теорию третьей неоламарковской концепции: прямое проникновение через барьер Вейсмана некоторых семейств генов, например, V-генов иммуноглобулинов.

Рис. 6.3. Обратная связь сомы и зародышевой линии (тяжелая цепь). В гл. 5 говорилось, что соматические мутации накапливаются в вариа-6enbHbixV(D)J-reHax В-лимфоцитов (рис. 5.5 и 5.6). Мутантные обратные транскрипты (кДНК), доставленные в половые клетки подвижными В-клетками и/или ретровирусами, встраиваются в ДНК зародышевой линии в результате гомологичной рекомбинации. Картина рекомбинации V-генов зародышевой линии установлена с помощью алгоритма генетической рекомбинации, разработанного Джорджем Уайлером (см. текст и Weiller et al., 1998). Главные точки рекомбинации в зародышевой линии обнаружены в точке начала транскрипции, на границе между L-V интроном и концом кодирующего V-участка. Этот результат согласуется с предположением о следах интеграции, которые обсуждаются в этой главе. Этот процесс показан и на рис 1.2, но не так подробно. См. также подписи к рис. 4.5, 5.5 и 5.6.

Простейшие модели этого процесса включают создание кДНК по матрице про-мРНК с помощью обратной транскрипции и последующую доставку этой копии в репродуктивные ткани мобильными клетками (например, лимфоцитами) или эндогенными ретровирусами, действующими как «генные челноки». (Напомним, что предполагаемый механизм соматического гипермутирования, обсуждаемый в предыдущей главе, также включает создание кДНК.) Последнее — это гомологич-ная рекомбинация, причем созданная кДНК замещает исходную последовательность зародышевой линии. У нас нет способа оценки частоты возникновения таких событий в ходе эволюции, хотя сила «соматической печати», которую мы видим на ДНК зародышевой линии, заставляет считать их довольно частым эволюционным событием.