Книга: Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Z-форма

Z-форма

Как мы уже говорили, Уотсон и Крик, а также их последователи, занимавшиеся моделированием структуры ДНК, опирались на данные по рассеянию рентгеновских лучей от волокон ДНК. Это были именно волокна, а не кристаллы, так как естественные, выделенные из клеток молекулы ДНК не кристаллизуются. Причина этого понятна – молекулы ДНК слишком длинные, чтобы из них можно было получить кристалл.

Определенная упаковка молекул при частичном высушивании раствора происходит – они укладываются подобно бревнам в запани (на лесосплаве), только не в двух измерениях, как на поверхности воды, а в трех. Промежутки, как и в запани, заполнены водой. Рассеяние рентгеновских лучей от подобного частично упорядоченного расположения молекул дает довольно богатую информацию, но недостаточную для однозначного восстановления структуры молекул, исходя только из рентгенограмм. Это обстоятельство и явилось причиной долгих споров о том, правильно ли Уотсон и Крик «угадали» структуру ДНК в волокнах.

После опытов Уонга, а также Шора и Болдвина создалась в определенном смысле парадоксальная ситуация. Стало ясно, что в растворе изолированные молекулы ДНК имеют структуру, в своих основных чертах соответствующую модели Уотсона—Крика. А в волокнах, в условиях возникновения взаимодействия между молекулами? Не изменяется ли структура? Специалисты, занимающиеся моделированием ДНК и расчетами того, как происходит рассеяние рентгеновских лучей от этих моделей, убеждали, что только В-форма ДНК может дать наблюдаемую картину. Но могли оставаться сомнения, не упустили ли они из виду что-либо.

Проблема была бы решена, если бы удалось все же получить кристаллы из ДНК, исследовать рассеяние рентгеновских лучей от этих кристаллов, а потом строго решить обратную задачу восстановления структуры по картине рассеяния. Именно так определяют пространственное строение обычных химических соединений любой сложности, а также белков. Но для ДНК это сделать не удавалось.

Ясно, что для длинных молекул или для коротких молекул, имеющих разную длину или разную последовательность, нет шансов получить кристаллы. Надежда была на то, что если взять короткие молекулы, содержащие около 10 пар оснований и имеющие одинаковую длину и последовательность, то их удастся как-то закристаллизовать.

Но получение кристаллов – это весьма кропотливое дело. Нужно варьировать маточный раствор, из которого ведется кристаллизация, так что требуются очень большие количества вещества. А где взять много кусочков ДНК строго заданной длины? Такие препараты стали доступны только в конце 1970-х годов благодаря потрясающим успехам в химическом синтезе ДНК с заданной последовательностью.

Успехи химиков в этой области действительно поражают. В свое время синтез Кораной троек нуклеотидов разной последовательности вызвал сенсацию и в конечном счете принес автору Нобелевскую премию. (Как, возможно, помнит читатель, эти тринуклеотиды позволили провести полную расшифровку генетического кода, см. главу 2.) К началу 1980-х годов стало возможным заказать небольшой ящик размером с пишущую машинку. На ящике кнопки с буквами А, Т, Г, Ц. Вы нажимаете кнопки в том порядке, какую вы хотите получить последовательность (но не более 20 нуклеотидов), засыпаете в ящик исходные ингредиенты, также выпускаемые промышленностью, и идете обедать. Потом вы можете сходить в библиотеку или на семинар, а вернувшись через несколько часов, обнаружите в выходном устройстве вашего ящика несколько миллиграммов препарата, который вы заказали. Но в последние годы народ совсем обленился. Теперь эти чудо-приборы пылятся на полках или, скорее всего, вообще выброшены на свалку, а кусочки ДНК нужной последовательности заказывают по Интернету на одной из множества фирм по смехотворной низкой цене.

Так или иначе, больше не существует проблем, связанных с искусственным синтезом гена. Из синтетических олигонуклеотидов можно при помощи лигазы сшить ген любой длины. Это решает также проблему получения в больших количествах коротких кусков ДНК для их кристаллизации. Впрочем, машины, синтезирующие куски ДНК, появились в самом начале 1980-х годов, но в конце 1970-х в некоторых лабораториях, занимавшихся синтезом генов, уже умели быстро синтезировать лоскутки ДНК, правда, вручную.

Впервые хорошие кристаллы маленьких кусочков ДНК удалось получить в 1979 году в лаборатории Александра Рича (Массачусетский технологический институт). Кристаллы были из гексануклеотидов:

Каково же было удивление Рича и его сотрудников, когда, проделав все необходимые очень трудоемкие процедуры, они получили наконец структуру своих кусочков. Эта структура не имела ничего общего с моделью Уотсона и Крика!

Нет, разумеется, у нее были нормальные пары ГЦ, и даже кусочек образовывал отрезок двойной спирали, но на виток спирали приходилось не 10, а 12 пар оснований. Но главное не это. Главное, что спираль была не правая, как в В-форме, а левая!

Имелся еще целый ряд принципиальных отличий этой новой структуры, названной авторами Z-формой, от В-формы ДНК. Название происходит от того, что, в отличие от В-формы, в которой сахарофосфатный остов образует плавную винтовую линию, в Z-форме эта линия имеет зигзагообразный вид (рис. 41).

Что же получается, неужели все-таки модель Уотсона—Крика оказалась в конечном счете неверной? Ведь первая же структура ДНК, найденная с помощью абсолютно надежных методов рентгеновской кристаллографии, оказалась принципиально отличной от В-формы.

Нет, открытие американских ученых при всей своей сенсационности не носит столь радикального характера. Опыты с кольцевыми ДНК однозначно свидетельствуют о том, что спираль ДНК в растворе правая и на виток спирали приходится 10 пар, что соответствует В-, а не Z-форме. Так что же, значит, в кристалле вследствие межмолекулярных взаимодействий структура двойной спирали столь сильно меняется? Нет, дело и не в этом.

Как удалось установить, тому, что изученный гексануклеотид оказался в Z-форме, способствовала главным образом строго чередующаяся последовательность Г и Ц.

Вскоре Р. Диккерсон и его сотрудники из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе определили структуру в кристалле ДНК другой последовательности:

Оказалось – В-форма. Стали изучать переход ДНК в Z-форму в растворе. Выяснилось, что при обычных условиях, по крайней мере в линейной ДНК, Z-форма не образуется. Ну а в сверхспирализованной?

Рис. 41. Так выглядят объемные модели Z– и В-формы ДНК. Черные линии нарисованы, чтобы показать ход сахарофосфатной цепи

Конечно, сверхспирализация должна делать Z-форму более выгодной, так как изменение знака спирали из положительного на отрицательный в отрезке ДНК снимает напряжение в остальной части отрицательно сверхспирализованной молекулы. Поэтому вполне естественно предположить, что в сверхспирализованной ДНК участки, имеющие чередующуюся последовательность Г и Ц, будут переходить в Z-форму. Так ли это?

Ответ на этот вопрос зависит от того, какова энергия перехода В – Z для участка, имеющего последовательность …ЦГЦГЦГЦГЦГ… Ведь помимо регулярной В-формы образование Z-формы должно стать более выгодным, чем образования креста, чтобы эта форма существовала. Ведь последовательность

это перевертыш, так что вопрос о том, переходят ли участки ДНК с подходящей последовательностью в Z – форму, совсем не прост. Его необходимо было исследовать экспериментально.

Как и в случае с крестами, наиболее эффективным методом выяснения вопроса о том, образуется ли Z-форма в отрицательно сверхспирализованной ДНК, оказался метод двумерного гель-электрофореза (см. главу 7). Только достаточно длинные участки …ЦГЦГЦГЦГ… в обычных плазмидах не встречаются. Поэтому потребовалось конструирование специальных плазмид, несущих искусственные вставки …ЦГЦГЦГЦГ… разной длины.

Дж. Уонг впервые применил к исследованию Z-формы метод двумерного гель-электрофореза. Исследуя плазмиды с длинными вставками …ЦГЦГЦГЦГ…, он наблюдал картинки типа приведенной на рис. 32 в условиях, когда для контрольной плазмиды, лишенной вставки, никакого разрыва на электрофореграмме не наблюдалось. Это означало, что наблюдаемый структурный переход происходил во вставке …ЦГЦГЦГЦГ… Но что при этом возникало – крест или Z-форма? Ответ на этот вопрос могла дать величина скачка, т. е. то, на сколько топоизомеров вверх происходил скачок при переходе. Если бы происходил переход в крест, то следовало ожидать скачок на т/10,5 топоизомеров, где т – число пар в перевертыше, т. е. в последовательности …ЦГЦГЦГЦГ… В случае же образования Z-формы следовало ожидать скачка на т (1/10,5 + 1/12,5) топоизомеров (12,5 – это число пар, приходящихся на виток левой спирали ДНК в Z-форме). Эксперимент дал четкий ответ – величина скачка отвечала образованию Z-формы, а не креста. Так было показано, что последовательности …ЦГЦГЦГЦГ… могут переходить в Z-форму в условиях, близких к физиологическим. Это позволяло надеяться, что Z-форма может возникать в ДНК внутри клетки и играть какую-то биологическую роль.

Образование Z-формы в ЦГ-последовательностях при отрицательной сверхспирализации ДНК можно регистрировать не только методом двумерного гель-электрофореза. Другой метод, широко применявшийся А. Ричем с сотрудниками, состоит в использовании антител к Z-форме. Эти антитела были получены путем иммунизации животных химически модифицированным ЦГ-полимером, который находится в Z-форме при любых условиях. Такие антитела не связываются с ДНК или ЦГ-полимером в В-форме, но сильно связываются с ЦГ-полимером, находящимся в Z-форме. Было показано, что искусственные плазмиды, несущие ЦГ-вставки, начинают связывать антитела к Z-форме, когда их отрицательная сверхспирализация становится достаточно высокой.

Анализ пространственной структуры Z-ДНК привел к заключению, что для этой формы ДНК важно регулярное чередование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в каждой из комплементарных цепей. Если такого чередования нет, то Z-форма становится сильно невыгодной по сравнению с В-формой. Поэтому можно было ожидать, что наряду с последовательностями …ЦГЦГЦГ… отрицательная сверхспирализация будет способствовать образованию Z-формы еще в двух простых пурин-пиримидиновых последовательностях:

и

Выяснение этого вопроса было особенно важно потому, что протяженные участки с такими последовательностями сравнительно часто встречаются в эукариотических ДНК. Были сконструированы специальные плазмиды, несущие такие вставки, и проведены опыты по двумерному гель-электрофорезу, связыванию антител к Z-форме, расщеплению однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что, как и ожидалось, ГТ-вставки переходят в отрицательно сверхспирализованной ДНК в Z-форму (образование крестов в таких последовательностях, очевидно, невозможно), а вот АТ-вставки образуют кресты.

Открытие Z-формы буквально всколыхнуло души молекулярных биологов. Вместе с доказательством существования крестов в сверхспиральных ДНК это открытие показало, что, хотя в целом ДНК, безусловно, находится в В-форме, отдельные ее участки могут иметь резко отличающуюся структуру. Начался поиск этих и других структур в ДНК и выяснение их возможной биологической роли.