Книга: Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Н-форма

Н-форма

В ходе работы по выяснению возможной биологической роли альтернативных (отличных от В-формы) структур наиболее популярным оказался ферментативный метод, так как он прост и позволяет локализовать на ДНК место атаки однонитевой эндонуклеазы. Дэвид Лилли (Университет Данди, Великобритания) показал, что кресты атакуются в центре перевертыша, а Роберт Уэллс (Алабамский университет, США) обнаружил, кроме того, что при образовании Z-формы атакуются границы между ней и В-формой.

Генные инженеры, встраивая все новые и новые участки ДНК из самых разных организмов в плазмиды, стали проверять их на чувствительность к однонитевой эндонуклеазе в надежде обнаружить кресты или Z-форму. Действительно, некоторые участки ДНК из высших оказывались очень чувствительными к ферменту. Они получили название гиперчувствительных мест. Когда удалось локализовать эти места, выяснилось, что они всегда находятся в важных регуляторных участках генома. Это привлекло к ним еще большее внимание. Когда же были определены их последовательности, то, к большому смущению исследователей, оказалось, что они – не перевертыши и не чередующиеся пурин-пиримидиновые участки. Как правило, гиперчувствительными к однонитевой эндонуклеазе оказывались последовательности, которые в одной цепи содержат только пурины, а в другой – только пиримидины, т. е. гомопурин-гомопиримидиновые последовательности типа (Г)n•(Ц)n или (ГА)n•(ТЦ)n.

Как же это следовало понимать? Может быть, однонитевая эндонуклеаза предпочтительно атакует такие последовательности, даже если они находятся в нормальной В-форме? Или эти последовательности способны принимать в сверхспиральной ДНК какую-то новую, до сих пор не обнаруженную форму ДНК?

Последняя возможность была особенно интересной, поскольку это означало бы, что мы еще не знаем о структуре ДНК что-то очень важное, причем это «что-то» могло оказаться существенным для функционирования ДНК в клетках эукариот. Специалисты по структуре ДНК взялись за работу, пытаясь выяснить образуют ли гомопурин-гомопиримидиновые последовательности альтернативную структуру, а если образуют, то какую именно.

Возможно, рассуждали одни, эти последовательности могут образовывать левую спираль, не Z-форму, а какую-то другую левоспиральную форму, одну из тех, что можно построить с помощью молекулярных моделей. Нет, возражали другие, все дело в том, что это очень однородные последовательности и поэтому две комплементарные нити могут проскальзывать друг относительно друга, образуя две однонитевых петли по краям гомопурин-гомопиримидинового участка. Однонитевая эндонуклеаза атакует эти петли, что и делает такие последовательности гиперчувствительными. А может быть, указывали третьи, такие последовательности образуют четверные спирали, еще одну гипотетическую структуру, предложенную теоретиками на основе «игры» с молекулярными моделями. Однонитевая эндонуклеаза атакует вершину такой структуры, где должны быть однонитевые петли.

Очень скоро стало ясно, что сам по себе факт гиперчувствительности к однонитевой эндонуклеазе мало что дает, тем более что оставался открытым вопрос об избирательном действии самого фермента. В начале 1985 года В. Лямичев, С. Миркин и автор этих строк (мы тогда работали в Москве, в Институте молекулярной генетики[3]) решили применить к исследованию этого запутанного вопроса метод двумерного гель-электрофореза.

Была сконструирована плазмида, несущая последовательность (ГА)₁₆ •(ТЦ)₁₆. Топоизомеры этой плазмиды были подвергнуты разделению методом двумерного электрофореза. На картинах электрофореза наблюдались характерные разрывы, как в случае крестов и Z-формы. Эти разрывы отсутствовали в контрольных экспериментах с плазмидой, в которую не был встроен участок (ГА)₁₆ •(ТЦ)₁₆. Пятна, отвечающие следующим за разрывом топоизомерам, исчезли из картин двумерного фореза после обработки плазмиды со вставкой однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что под действием отрицательной сверхспирализации в гомопурин-гомопиримидиновой последовательности на самом деле образуется некая альтернативная структура. Но, может быть, образуется одна из уже известных альтернативных структур, крест или Z-форма, просто требования к последовательности на самом деле не столь строги, как принято считать?

Эта возможность полностью исключалась, так как обнаруженный переход оказался очень чувствительным к кислотности среды. При добавлении в среду кислоты переход резко облегчался. Более того, при достаточной кислотности переход наблюдается вообще в релаксированной, несверхспирализованной ДНК! Стало ясно, что речь идет на самом деле о какой-то совершенно новой структуре, поскольку ни одна из известных ранее структур не была столь чувствительной к кислотности среды. Так как эта загадочная структура стабилизировалась кислотой, т. е. ионами водорода, мы назвали ее Н-формой.

У нас в руках были две очень важные количественные характеристики Н-формы. Во-первых, величина скачка при электрофорезе, которая свидетельствовала о том, что в Н-форме комплементарные цепи не закручены друг относительно друга (как и в случае крестов). Во-вторых, зависимость сверхспирализации, при которой происходит переход из В – в Н-форму, от кислотности среды. Теоретический анализ этой зависимости показывал, что в Н-форме на каждые четыре пары оснований вставки (ГА)₁₆ •(ТЦ)₁₆ приходится одно место связывания протона. Нам никак не удавалось придумать структуру, которая бы удовлетворяла этому требованию.

В то время, когда мы ломали головы над этой загадкой, наше внимание привлекла статья А. Р. Моргана и Джероми Ли (Университет Альберты, Канада), опубликованная несколькими годами раньше. Канадские ученые исследовали синтетическую ДНК, комплекс поли (ЦТ) •поли (АГ). Они обнаружили, что в кислой среде пара таких двойных спиралей объединяется в тройной комплекс, состоящий из двух цепей ЦТ и одной цепи АГ. Вторая цепь АГ оказывается «лишней». Тройной комплекс состоит из триад, структура которых приведена на рис. 42. Для нас очень существенно то, что триада ЦГЦ⁺ образуется путем захвата из среды одного протона. Это и объясняет, почему такая структура образуется, в отсутствие сверхспирального напряжения, только в кислой среде. На основе этих данных мы предположили, что Н-форма имеет структуру, показанную на рис. 43.

Рис. 42. Структура триад ТАТ и ЦГЦ⁺, из которых строится тройная спираль ДНК. В основе каждой триады лежат обычные уотсон-криковские пары А •Т и Ц •Г (см. рис. 38), к которым присоединяется третье основание. Такой необычный способ присоединения оснований впервые наблюдал в кристаллах К. Хугстин. Для образования хугстиновской пары ГЦ цитозин должен захватить из раствора лишний ион водорода, т. е. протон. Штриховыми линиями показаны водородные связи между основаниями. Как и в случае уотсон-криковских пар, обе триады имеют одинаковые расстояния между атомами азота, связанными с сахаром

Рис. 43. Структура Н-формы ДНК для участка (ГА)₁₆ •(ТЦ)₁₆, встроенного в плазмидную ДНК. Основной элемент структуры – тройная спираль, состоящая из триад, приведенных на рис. 42. Показаны два возможных «изомерных» варианта структуры. Уотсон-криковское спаривание обозначено затемненными кружками, хугстиновское спаривание ГЦ, в котором участвует дополнительный протон, обозначено крестиками

Ясно, что такая структура должна быть очень чувствительна к однонитевой эндонуклеазе, так как половина пуриновой нити вставки находится в однонитевом состоянии.

Мы исследовали также вставки (Г)n •(Ц)n и другие регулярные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности. Во всех случаях наблюдалось образование Н-формы.

Так что же, Н-форма может возникнуть в любой гомопурин-гомопиримидиновой последовательности? Нет, согласно модели (рис. 42), гомопурин-гомопиримидинового характера последовательности недостаточно. Требуется еще, чтобы последовательность была зеркальным перевертышем, т. е. чтобы она одинаково читалась справа налево и слева направо по одной и той же цепи (в отличие от обычных перевертышей, образующих кресты, которые одинаково читаются по разным цепям). Понятно, почему все регулярные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности образуют Н-форму – ведь они как раз принадлежат к классу зеркальных перевертышей. Легко, однако, придумать нерегулярную последовательность – зеркальный перевертыш, скажем:

Не важно, что центральная последовательность не является гомопурин-гомопиримидиновой, – все равно она окажется в петле в Н-форме (рис. 43). Эксперимент полностью подтвердил наши ожидания, что зеркально-симметричные гомопурин-гомопиримидиновые последовательности переходили в Н-форму, тогда как малейшее нарушение симметрии предотвращало переход. Эти и многие другие опыты доказали правильность предложенной нами структуры Н-формы.

Открытие Н-формы инициировало настоящий бум в изучении тройных спиралей ДНК, начавшийся в середине 1980-х годов и продолжающийся по сегодняшний день.

Мы теперь знаем, что сверхспирализация может вызывать образование в ДНК альтернативных структур трех типов: крестов, Z-формы и Н-формы. Вопрос о биологической роли этих структур находится в стадии интенсивного изучения во многих лабораториях.