Книга: Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ

Первый этап – адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, у них сохраняются свободными активные центры, и поэтому они способны специфически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап – связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело + антиген, происходящей на границе твердая фаза – жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап – обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело + антиген специфическими антителами против данного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело + антиген + меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит H₂O₂ в смеси с ортофенилендиамином, используемая в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора субстрата приводит к тому, что он подвергается действию пероксидазы, фиксированной на антителах; образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой может быть определена путем фотометрирования.

Радиоиммунный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов (рис. 75, а).

Рис. 75. Схема использования иммуноферментного и радиоиммунного методов для обнаружения антигенов (а) и антител (б):

1. Поверхность твердой фазы. 2. Специфические антитела. 3. Антиген (исследуемый материал). 4. Cпецифические к данному антигену антитела, меченные ферментом (5) или изотопом (6). 7. Субстрат для фермента. 8. Специфический антиген. 9. Исследуемая сыворотка (антитела). 10. Антивидовая сыворотка, содержащая антитела к человеческому иммуноглобулину, меченные ферментом (11) или изотопом (12). 13. Субстрат для фермента