Книга: Чума

4.6. Дополнительные замечания по диагностике чумы

4.6. Дополнительные замечания по диагностике чумы

Необходимо обратить внимание читателя на важность лабораторной диагностики чумы, при которой решающее слово принадлежит не врачу или эпидемиологу, а лабораторной службе [Комитет экспертов ВОЗ по чуме, 1971]. Она необходима для подтверждения всех случаев заболевания, особенно спорных или в начале вспышки среди людей, определения источника заражения, установления границ очага, решения вопросов об объеме противоэпидемических мероприятий и их отмене; не меньшее значение она имеет при обследованиях природных очагов и для контроля за последними. Основное значение при этом мы придаем бактериологическим исследованиям, поскольку только выделение культуры Y. pestis является бесспорным доказательством чумы. Все остальные методы, будь то ускоренные, серологические, а теперь и молекулярно-биологические, пригодны лишь для рекогносцировки и постановки предварительного или ретроспективного диагноза. Тут же укажем, что клинический и биохимический анализы крови имеют весьма ограниченную ценность. В этом легко убедиться, познакомившись с множеством противоречивых данных [Домарадский И. В., 1966; Butler T., 1983]. К ним следует прибегать только для контроля за состоянием больных или если при заболеваниях, от которых дифференцируют чуму, имеются характерные изменения.

Отрицательный ответ лаборатории при наличии клинических и эпидемиологических указаний на наличие чумы не исключает проведения соответствующих мероприятий [Руднев Г. П., 1972].

Для лабораторного исследования используют пунктаты бубонов, отделяемое язв, кровь, мокроту, секционный материал, органы и кровь животных, воду, пробы почвы из нор грызунов [Bahmanyar M., Cavanaugh D. C., 1976] и даже пробы воздуха из помещений, где лежат больные с "чумной пневмонией" [Николаев Н. И., 1968]. Иногда исследуют также частицы одежды или смывы с предметов, загрязненных больными. Сейчас усиленно рекомендуют подвергать лабораторному исследованию также материал из зева больных и лиц, бывших в контакте с ними. Описание методики отбора, доставки в лабораторию и подготовки материалов для исследования можно найти в специальных руководствах, например, А. В. Наумова и Л. В. Самойловой [1992] или M. Bahmanyar и D. C. Cavanaugh [1976]. Отметим лишь, что забор материала должен проводиться с соблюдением строгих мер предосторожности, особенно в тех случаях, когда имеется подозрение на легочную чуму.

Несмотря на то, что в диагностике чумы основное место мы отводим бактериологическим методам, необходимо все же остановиться и на других.

В настоящее время серологические методы исследований прочно вошли в практику во всем мире, в чём немалая заслуга работников противочумной системы СНГ [Сучков Ю. Г., 1963]. Серологические методы пригодны для массовых обследований и получения предварительных результатов; они доступны для работы в любых условиях и сравнительно недороги, чем выгодно отличаются от бактериологических методов. Роль серологических реакций особенно велика, когда необходима постановка ретроспективного диагноза у людей, лечённых антибиотиками, при стертых формах чумы или смешанных инфекциях [Bahmanyar M., Cavanaugh D. C., 1976]. Однако повторяем, что серологические методы могут давать "осечки". Одна из причин этого заключается в том, что все или почти все серологические реакции основаны на наличии у чумного микроба FI и, если у микробов FI нет, то с помощью серологических реакций обнаружить их нельзя. С другой стороны, специфичность антител неабсолютна и поэтому возможна "гипердиагностика". Об одном таком случае говорилось в разделе 3.9.2. Со вторым случаем столкнулись в Японии: при обследовании R. norvegicus было отловлено несколько крыс, дававших положительные реакции на чуму, однако изолировать от них её возбудителя так и не удалось [Suzuki T., Hotta S., 1979].

Из числа серологических реакций для широкой практики наибольший интерес представляют сейчас различные варианты гемагглютинационного теста, вытеснившие реакции агглютинации и связывания комплемента (первая (малоспецифична, вторая (слишком сложна) [Леви М. И. и др., 1964].

Для выявления чумного микроба применяют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА), в которой диагностикумом служат формалинизированные бараньи эритроциты, сенсибилизированные антителами к FI (нередко моноклональными), а для определения антител к чумному микробу используют РПГА с "антигенным" диагностикумом. Подробности подготовки проб к анализу, постановки реакций и учёта результатов содержатся в руководствах А. В. Нумова и Л. В. Самойловой [1992], Леви М. И. [1995], M. Bahmanyar и D. C. Cavanaugh [1976], и др.

Наряду с гемагглютинационными тестами, за последние годы все шире начинают применять различные варианты иммуноферментного анализа (ИФА). Эти методы отличаютcz относительнjq простотjq выполнения, доступность. и стабильностью реагентов, объективным учётом результатов и возможностью автоматизации. В 1982 г. на экспериментальных животных, заражённых чумой, под бактериологическим контролем была проведена сравнительная оценка ИФА и РПГА. Как показали опыты, информативность ИФА оказалась намного выше. Радиоиммунный метод [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992] скажем лишь, что интереса для практики он не представляет.

Остановимся на молекулярно-биологических методах диагностики, из числа которых сейчас наибольшего внимания заслуживает гибридизация. При прочих равных условиях, молекулярная гибридизация предпочтительнее других методов в следующих случаях:

— при изучении микроорганизмов, которые трудно культивировать (вирусы, возбудители лепры или туберкулёза, лептоспиры, микоплазмы и пр.) или которые быстро меняют антигенную структуру (возбудители гриппа и ящура, кампилобактер, нейссерии и др.);

— когда иммунитет носит преимущественно клеточный характер;

— при наличии в исследуемых объектах нежизнеспособных бактерий данного вида, даже в присутствии посторонних микроорганизмов;

— если возникает необходимость быстро дать ответ о лекарственной резистентности;

— когда надо решить вопрос, не прибегая к опытам in vivo, обладает ли штамм вирулентностью или токсигенностью.

Для диагностики возбудителя чумы предложены полинуклеотидные зонды, в частности относительно небольшой (900 пар оснований) фрагмент pPst [McDonough K. A. et al., 1988]. Было показано, что этот зонд пригоден для выявления чумного микроба у блох и в органах животных [Thomas et al., 1989]. С его же помощью K. A. McDonough и S. Falkow [1989] смогли найти объяснение роли плазмокоагулазы и фибринолизина в экологии чумного микроба. Сходный зонд (pLD625) получен также мною совместно с А. Л. Мельниковым [а. с. СССР, № 284593 от 11.10.88, с приоритетом от 27.10.87]. Поскольку оба зонда получены из pPst, присущей только чумному микробу, они обладают высокой специфичностью.

Относительно недавно сконструирован также олигонуклеотидный зонд [Kapperud G. et al., 1990]. Это стало возможным после расшифровки нуклеотидной последовательности гена вирулентности yopA на pCad [Forsberg A. et al., 1987; Skurnik M. и Wolf-Watz H., 1989]. В отличие от зонда на основе pPst этот зонд обладает групповой специфичностью (выявляет вирулентные штаммы Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Тем не менее в сочетании с зондом на основе pPst олигонуклеотидный зонд может помочь повысить эффективность поиска возбудителя чумы в природных очагах, особенно в межэпизоотический период.

До сих пор применению молекулярной гибридизации в полевой практике мешает необходимость маркировки зондов радионуклидами [Наумов А. В., Самойлова Л. В., 1992] и связанная с этим трудность регистрации результатов. Поэтому мы разработали другой метод маркировки зондов, включая олигонуклеотидные. Принцип его заключается в гаптенизации азотистых оснований в составе зондов, получении к ним специфических антител и регистрации результатов, как при ИФА. Этот принцип не нов, но в сочетании с некоторыми особенностями его реализации он приобрел определенную оригинальность, позволяющую рассчитывать на возможность его широкого применения [а. с. СССР, № 1637336 от 3.05.89 и № 1659487 от 2512.88].

В последнее время в практику исследований на чуму начинают внедрять полимеразную цепную реакцию (ПЦР), которая лишена многих недостатков, присущих гибридизации, и позволяет в течение нескольких часов определить единичные клетки возбудителя.

В заключение упомянем еще об одном ускоренном методе выявления чумного микроба, обладающем большой разрешающей способностью. Мы имеем в виду реакцию нарастания титра фага [Домарадский И. В. и др., 1957]. Принцип метода основан на том, что титр индикаторного фага резко, на несколько порядков, возрастает в присутствии живых бактерий (его хозяев, и не изменяется в контрольных пробах, где этих бактерий нет. К недостаткам метода можно отнести необходимость титрования фага по методу Грация, однако сейчас предложены модификации метода, которые лишены этого недостатка, хотя и нуждаются еще в доработках [Апарин Г. П., Голубинский Е. П., 1989; Голубинский Е. П. и др., 1992].