Книга: Биологически активные

Кооперативность

Кооперативность

Все рассмотренные представления относятся к случаю, когда константа диссоциации комплекса К, определяющая сродство лиганда к рецептору, постоянна. По счастью, такая ситуация характерна для большинства исследованных биорегуляторов. По счастью, поскольку это облегчает изучение молекулярных механизмов их действия, и без того достаточно сложно организованных; поскольку все же с уверенностью утверждать факт постоянства К можно лишь в большинстве, но не во всех случаях, не мешает рассмотреть и эти исключения, тем более что в специальной литературе им уделено очень много места.

Наиболее тщательно изученные модели базируются на предположении, что сродство молекулы биорегулятора к рецептору может изменяться в зависимости от того, какое количество таких молекул уже связано клеткой. Пусть, скажем, каждый рецептор может связывать не одну, а несколько молекул лиганда; в этом случае говорят о многовалентном рецепторе. Можно себе представить, что после присоединения первой молекулы и возникновения комплекса структуры А, посадка на рецептор следующей молекулы будет затруднена или, наоборот, облегчена, так что реакции R + A ? RA и RA + A ? RA₂ будут протекать в неодинаковых условиях и константы диссоциации соответствующих комплексов окажутся различными. В принципе возможны самые разнообразные комбинации знака эффектов, вызванных присоединением очередной молекулы лиганда: скажем, связывание второй молекулы лиганда происходит легче, чем первой, третьей – трудней, четвертой – опять легче и т.д. Однако наиболее исследованными и единственными обнаруженными в природе оказались ситуации, когда присоединение каждой последующей молекулы облегчается вследствие посадки предыдущей (явление положительной кооперативности) или, наоборот, затрудняется (отрицательная кооперативность).

Положительная кооперативность была обнаружена и основательно исследована еще 60...70 лет назад, правда, не в связи с процессами взаимодействия молекул биорегуляторов с их специфическими рецепторами, а на примере связывания кислорода молекулой гемоглобина. Эта молекула состоит из четырех субъединиц: двух ?- и двух ?-цепей. Каждая из субъединиц может связывать одну молекулу кислорода. Так вот, оказалось, что сродство к кислороду каждого центра связывания (гема) тем выше, чем больше других центров связывания уже занято кислородными молекулами. В работах американского исследователя Д. Эдера, давшего математическое описание связывания кислорода гемоглобином, были заложены основы общей теории кооперативных сорбентов; явления, подобные рассмотренным, характерны для многих процессов, протекающих в биологических и небиологических системах.

На одной из конференций по теории рецепторов был приведен образный пример, иллюстрирующий понятия положительной и отрицательной кооперативности.

Представим себе небольшое кафе. Раннее утро, еще сонные, спешащие на работу посетители наскоро завтракают. Понаблюдаем за тем, как они рассаживаются: каждый норовит обособиться, сесть за свободный столик, если таковых нет, подсесть туда, где находится только один посетитель и т.д. То есть налицо типичная отрицательная кооперативность: вероятность того, что вновь прибывший гость займет место за данным столиком тем меньше, чем больше людей там уже сидит.

Вечером кафе заполняют в основном завсегдатаи; здесь все обстоит наоборот: каждый появившийся в кафе посетитель старается подсесть к знакомой компании, некоторые даже подтаскивают дополнительные стулья (впрочем, это уже усложнение принятой нами модели, изменение валентности рецептора, так что предположим лучше, что строгий хозяин запрещает перестановку стульев). Здесь наблюдается положительная кооперативность: вероятность выбора новоприбывшими места за данным столиком выше, если за ним уже кто-то сидит.

Всякому, кто более или менее систематически следит за литературой о механизмах действия биологически активных соединений, термин «кооперативность» изрядно примелькался. Очень охотно обращаются авторы многих сочинений этого жанра к гипотезам о наличии в исследованных ими рецепторных системах положительной или отрицательной кооперативности. Почти всегда это именно гипотеза, случаи, когда представляются вполне надежные доказательства существования кооперативных эффектов, сравнительно редки. И тем не менее слово «кооперативность» бестрепетной рукой выносится в заголовок: «Положительная кооперативность... рецепторов ацетилхолина... миокарда крысы», «Доказательство отрицательной кооперативности системы рецепторов...», скажем, кортикотропина, и не крысы уже, а гималайской коровы или багрового хомячка с острова Св. Гервазия.

В поисках объектов, на которых удобнее всего изучать организацию той или иной системы рецепторов, исследователи, кажется, добрались во все решительно уголки света. Здесь и какие-то экзотические угри, и электрический орган южноамериканской рыбы торпедо, и нильская щука, и морские змеи из Южно-Китайского моря. В большинстве работ, разумеется, используются традиционные лабораторные животные: мыши, крысы, кролики, морские свинки. Впрочем, последние тоже имеют экзотическое происхождение. Родом они из Перу, их английское название – guinea pig – нередко и переводится неопытными переводчиками научных текстов буквально: «гвинейская свинья». Откуда взялось русское название этого симпатичного, но совершенно сухопутного зверька? Полагают, что вследствие искажения первоначально существовавшего «заморская свинка».

Впрочем на экзотических ли, тривиальных ли объектах бывают обнаружены признаки кооперативности связывания рецепторами биорегуляторов, такие сообщения всегда настораживают скептически настроенных специалистов. И тому есть свои причины.

Существует несколько характерных признаков кооперативности. Можно, например, препарат рецепторов, насыщенный радиоактивным лигандом, перенести в среду, его не содержащую, и измерять скорость диссоциации «меченых» комплексов. При этом часть препарата помещается в раствор, содержащий высокую концентрацию немеченного лиганда, часть – в раствор без лиганда. Если в первом случае скорость распада комплексов с участием радиоактивного лиганда выше, это может свидетельствовать о наличии отрицательной кооперативности: нерадиоактивный лиганд, связываясь со свободными, незанятыми радиоактивными рецепторами, «ослабляет» меченые комплексы. И, наоборот, если в присутствии нерадиоактивного лиганда скорость диссоциации снижается, можно думать, что это проявление положительной кооперативности.

Можно рассчитать константы скорости связывания лиганда препаратом рецепторов при высоких и низких концентрациях; если они окажутся различными, это также можно рассматривать как признак кооперативности – положительной или отрицательной, в зависимости от того, в каком именно случае эта величина окажется больше.

Но, пожалуй, самый популярный среди исследователей способ выявления кооперативности – это анализ характера отличий концентрационной зависимости количества связавшегося лиганда от уравнения Лэнгмюра.

Каким образом это сделать? Наиболее наглядной демонстрацией кооперативности было бы установление характера зависимости константы диссоциации от концентрации лиганда: растет с концентрацией отрицательная кооперативность, падает положительная. Согласно уравнению И. Лэнгмюра K = (Q – z)C/z; рассчитав ее для каждой точки экспериментальной кривой, получим искомую ее зависимость.

Однако исторически сложилась несколько иная практика.

Установив экспериментальным путем концентрационную зависимость z(c), исследователь хочет на ее основании оценить величины К и Q, характерные для изучавшейся системы. Вообще-то математическая теория обработки результатов эксперимента рекомендует для этой цели вполне определенную вычислительную процедуру, но она довольно громоздка и в докомпьютерный период применялась исследователями неохотно. Вместо этого для анализа экспериментальных данных стали использовать так называемые линеаризованные формы уравнения Лэнгмюра. Начало этому приему было положено самим Лэнгмюром в 1918 году; всего же было предложено несколько способов представления лэнгмюровской зависимости в линейной форме.

Например, перепишем ее следующим образом: z/C = (Q – z)/K. Результаты эксперимента можно представить графически, откладывая по оси ординат отношение z/C, по оси абсцисс – z. Получим так называемый график Скэтчарда. И если исследуемая зависимость действительно подчиняется уравнению Лэнгмюра, нанесенные по результатам эксперимента точки должны укладываться на прямую, причем ее наклон окажется равным 1/К, а точка ее пресечения с осью ординат – Q/K. Искомые параметры можно, таким образом, получить довольно просто, с помощью линейки и несложных арифметических действий.

График Г. Скэтчарда – не единственный способ линеаризации; всего их предложено четыре, некоторые – независимо различными авторами, и существует даже ряд научных публикаций по истории различных методов линеаризации уравнения Лэнгмюра.

Эти приемы используются не только для анализа изотерм адсорбции; точно ту же форму, что и уравнение Лэнгмюра, имеет основное уравнение ферментативной кинетики–уравнение Михаэлиса–Ментен. Именно в ферментативной кинетике применение линеаризованных форм получило чрезвычайно широкое распространение.

Помимо первоначального назначения – получения оценок констант Q, K, линеаризованные графики оказались полезными и в еще одном отношении. С их помощью можно продемонстрировать различного рода отклонения найденных на опыте зависимостей от формы, определяемой уравнением Лэнгмюра. Против такой практики постоянно протестовали и продолжают протестовать специалисты от математических методов обработки экспериментальных данных – пока лишь с весьма умеренным успехом.

В частности (ради этого, собственно, и состоялся весь разговор о линеаризация), на скэтчардовских графиках очень наглядно проявляются признаки кооперативности Если для изучаемого процесса характерна отрицательная кооперативность, экспериментальные точки на скэтчардовском графике образуют вместо прямой вогнутую кривую, при наличии же положительной кооперативности – выпуклую. Нелинейность скэтчардовских графиков – один из наиболее часто используемых доводов в пользу гипотез о кооперативности рецепторных систем.

С другой стороны, почти все такие признаки могут быть обусловлены не кооперативностью того или иного типа, а причинами совершенно иными; например, вогнутые графики Скэтчарда получаются и в том случае, если препарат содержит несколько типов центров связывания с различными константами диссоциации, а именно это чаще всего и наблюдается на практике.

Так же неоднозначно могут быть истолкованы и другие критерии кооперативности. И поэтому кажется удивительным обилие публикаций, авторы которых на основании результатов одного-двух простейших экспериментов спешат сообщить об открытии кооперативности связывания рецепторами такого-то и такого биорегулятора. Беда, по-видимому, в том, что само это явление как-то по-особенному волнует воображение. Перед мысленным взором исследователя возникают таинственные механизмы взаимодействия соседних рецепторов, конформационные перестройки и локальные фазовые переходы в мембране и бог знает еще какие удивительные эффекты.

К сожалению, наблюдать их непосредственно очень трудно, порой и вовсе невозможно, но тем больше соблазна о них пофантазировать (и, соответственно, меньше риск немедленного опровержения). Такая тенденция была названа в одном специальном сочинении «фармакологически-романтической», а суть ее определена следующим образом: «Например, измерена концентрационная зависимость связывания лиганда препаратом клеток-мишеней – и безапелляционный вывод: для этого процесса характерен эффект отрицательной кооперативности. Одна молекула эффектора, связываясь с рецептором, вызывает изменение конформации не только его самого, но и соседних рецепторов, что указывает на наличие дальнодействующих факторов, обусловливающих перестройку мембранных структур. Кстати, зная поверхностную плотность рецепторов на мембране, легко вычислить радиус этого дальнодействия.

Можно было бы задать вопрос автору такого вот утверждения (чего, к сожалению, почти никогда не делается): откуда такое точное видение молекулярной картины случившегося? Как же, последует незамедлительный ответ, здесь же имеет место типичный признак отрицательной кооперативности – коэффициент Хилла (параметр, характеризующий уклонение концентрационной кривой от лэнгмюровской формы. – С.Г.) меньше единицы. И уж совершенно бесполезно советовать поискать причины в чем-нибудь другом: может быть, например, препарат содержит несколько типов центров связывания? Бесполезно потому, что предлагаемые вами объяснения – это нечто будничное, обыденное, а кооперативность и особенно конформационные перестройки – волнующий намек на тайные свойства биологических мембран, живой клетки. В этом, по-видимому, одна из особенностей «фармакологического романтизма», выбирая между гипотезой тривиально простой и волнующе-сложной, романтик, безусловно, выберет вторую вопреки всякой научной логике!»

В этой связи вспоминается поучительная история. В 1973 году появилась статья группы американских авторов под заглавием: «Взаимодействие инсулина с рецепторами: экспериментальное доказательство отрицательной кооперативности». Исследовалось связывание радиоактивного инсулина препаратом рецепторов, диссоциация «меченых» комплексов в присутствии и в отсутствии нерадиоактивного гормона и т.п., на основании анализа результатов этих экспериментов был сделан вывод: есть отрицательная кооперативность! Поскольку признаков такой кооперативности было несколько, работа была воспринята специалистами с большим доверием, чем заявления типичных «фармакологических романтиков», вполне серьезные исследователи стали задумываться над молекулярными механизмами, лежащими в основе этого явления, и его физиологическим смыслом.

Увы, нашлись и приземленные скептики, напрочь, как видно, лишенные игры фантазии сухари – уже упоминавшийся П. Куатреказас и М. Холленберг. Они повторили те же опыты, только использовали вместо препарата инсулиновых рецепторов неорганические сорбенты – тальк, стекло, кремнезем. И оказалось, что для процессов взаимодействия меченого инсулина с этими материалами характерны в точности те же признаки отрицательной кооперативности!

Предложили они и свое объяснение этому обстоятельству. Неважно, каким материалом связывается инсулин, важно, что при высоких его концентрациях образуются в растворе попарные агрегаты его молекул – димеры, уже гораздо менее склонные к адсорбции на чем бы то ни было: специфических ли рецепторах или бездушном асбесте.

Самое забавное, впрочем, – публикация Куатреказаса и Холленберга не произвела решительно никакого впечатления на сторонников гипотезы «отрицательной кооперативности» рецепторов инсулина. Хотя и опубликована была в том же международном журнале «Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях».

Один немолодой уже, многоопытный геолог сказал мне как-то доверительно, что их, вечных скитальцев, геологов-профессионалов, ничто так не раздражает, как слово «р-р-романтика» (так он его и произнес). Не исключено, что и трезво мыслящих фармакологов – тоже.