Книга: Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Узлы из двойной спирали

Узлы из двойной спирали

Итак, впервые молекулу завязали в узел. То, что было не под силу химикам-синтетикам, удалось молекулярным биологам. Конечно, это было только начало. Было очень заманчиво завязать в узел двухнитевую ДНК. Сделать это в принципе нетрудно. Наиболее подходящим объектом казалась ДНК бактериофага ?.

Этот фаг был излюбленным объектом изучения в фаговой группе, собранной в свое время Дельбрюком. Когда возникла молекулярная биология, он стал вместе со своей клеткой-хозяйкой (кишечной палочкой) главным полигоном для изучения репликации, транскрипции, организации генов.

Внутри фаговой частицы ДНК фага ? линейна, но у нее есть «липкие» концы – однонитевые взаимно комплементарные участки, содержащие по 12 нуклеотидов, т. е. она выглядит примерно так:

Если такой ДНК дать возможность свободно плавать в растворе, то «липкие» концы сомкнутся и ДНК превратится в кольцо. Поскольку эта молекула довольно длинная (в ней около 50 тысяч пар нуклеотидов), то при замыкании в кольцо она с довольно высокой вероятностью завяжется в узел.

Вспомним, что двухцепочечная ДНК – это очень жесткая цепь, один ее сегмент содержит около 300 пар оснований. Поэтому оценивать вероятность образования узла в двунитевой ДНК можно с помощью графика, приведенного на рис. 36 и основанного на компьютерных расчетах. По нему выходит, что около половины молекул ДНК фага ? при замыкании должны образовать узлы. Беда в том, что для такой длинной ДНК очень трудно отличить нетривиальный узел от тривиального. Во всяком случае пока это сделать не удалось. Липкие концы нужны ДНК фага ? как раз для того, чтобы замыкаться в кольцо, попадая в клетку-хозяйку. Если она не замкнется, то не сможет реплицироваться и вообще нормально работать (если, конечно, можно назвать работой тот разбой, который она учиняет, попав в кишечную палочку).

И вот тут возникает вопрос, на который необходимо найти ответ. А что будет, если при замыкании в кольцо ДНК завяжется в узел – ведь теория показывает, что это вполне вероятно? Не повредит ли это ее работе в клетке? Ведь вирусная ДНК должна произвести множество копий самой себя. Если завязывание в узел мешает этому, то, значит, в клетке должны существовать специальные механизмы, препятствующие образованию узлов. Но что это за механизмы?

Убедиться в том, что ДНК, завязанной в узел, будет трудно удваиваться, вы можете сами. Возьмите полоску бумаги и склейте из нее нетривиальный узел, например трилистник. Затем ножницами разрежьте полоску вдоль, на две половины. Это будет моделировать удвоение ДНК, во всяком случае один из возможных вариантов удвоения. Вы увидите, что вам не удастся развести два образовавшихся узла. Эти вопросы были подняты нами в уже упоминавшейся статье в журнале Nature. Ответ пришел спустя пять лет.

В 1980 году Л. и Ч. Лю и Б. Олбертс сообщили, что после многолетних поисков им удалось наконец подобрать условия, в которых обычная двунитевая ДНК образует узлы. Они работали не с ДНК фага ?, в которой узлы трудно обнаружить из-за большой длины, а с короткими кольцевыми молекулами. Оказалось, что если к таким молекулам добавить одну из топоизомераз в большом избытке, то очень эффективно идет образование узлов. Об их возникновении можно судить по тому, что в геле при электрофорезе появляются фракции ДНК с большой подвижностью. Авторы пошли дальше – обработали заузленные молекулы топоизомеразой, но взятой в низкой концентрации и в присутствии АТФ. Что же произошло? Узлы развязывались!

Последнее событие произошло в полном соответствии с теорией, так как использовавшаяся ДНК была короткой и равновесная доля узлов в ней не должна была превышать 5 %.

Образование узлов при избытке фермента вызвано, по-видимому, тем, что белок, связываясь с ДНК, меняет физические свойства молекулы, прежде всего усиливает слипание удаленных вдоль цепи звеньев. Как показывают расчеты, такое слипание должно резко увеличивать вероятность образования узла.

Открытие американских ученых вызвало целый поток аналогичных публикаций. Немедленно для получения узлов были применены методы генной инженерии.

Итак, топоизомеразы явно делились на две группы. Одни делают узлы на однонитевых ДНК. Их стали называть топоизомеразами I, другие специализируются на двунитевых молекулах, их назвали топоизомеразами II.

Но это были еще не все новости. Выяснилось, что топоизомеразы II, к которым относится и ДНК-гираза, не только умеют завязывать и развязывать узлы, но и объединяют две или более молекулы ДНК в катенаны (т. е. делают их зацепленными).

Способность белков образовывать узлы вызвала большой интерес. Прежде всего она позволила понять, как работают топоизомеразы и, в частности, важнейший фермент этого класса – гираза. Ведь завязать кольцевую замкнутую ДНК в узел невозможно, не разорвав двойную спираль. Но мало просто разорвать цепь. Нужно еще протащить через образовавшуюся брешь другую часть молекулы, а потом заделать брешь. Вот какую сложную работу проделывает топоизомераза II.

Получается, что ДНК в присутствии этого фермента ведет себя так, будто на нее не распространяется запрет материальным телам проходить друг сквозь друга. Конечно, все дело здесь в ферменте – без него ничего не получилось бы. Ведь ДНК – не электрон или ?-частица, для которых возможен эффект квантового туннелирования. Топоизомеразы позволяют ДНК вести себя в клетке не менее странным образом.

Это как если бы вы, играя в теннис, попали мячом в сетку, а он взял и преспокойненько пролетел бы сквозь нее. Но, подбежав к сетке, вы не обнаруживаете дырки, сетка совершенно цела и невредима. Теперь ясно, как клетка решает ДНКовые топологические проблемы и, в частности, проблему репликации заузленных молекул.

Можно ли на основе сказанного понять, как ДНК-гираза меняет сверхспирализацию ДНК? Оказывается, можно. На рис. 37 видно, что если протаскивать один участок ДНК сквозь другой, то возникает сверхспираль, так как меняется величина райзинга, причем Wr всегда меняется на ±2. Именно это было и обнаружено экспериментально. В отличие от топоизомераз I, меняющих Lk ДНК на любое целое число, топоизомеразы II меняют Lk только на четное число. Дальнейшие исследования показали, что и работа топоизомераз типа I также идет путем образования разрывов и протаскивания цепи через образовавшуюся брешь. Только в отличие от топоизомераз типа II топоизомеразы I проделывают этот трюк не с двойной спиралью, а с однонитевой ДНК, так что, по-видимому, узлы в однонитевой ДНК завязываются топоизомеразой I точно так же, как узлы в двунитевой молекуле – топоизомеразой II.

Рис. 37. Три «топологические реакции», катализируемые топоизомеразой II; а – изменение числа витков сверхспирали ?Lk = ±2); б – развязывание и завязывание узлов: в – расщепление и образование катенанов

Открытие топоизомераз и выяснение механизма их работы лишило почвы одно из основных возражений против двойной спирали, всплывавшее вновь и вновь за прошедшие с момента открытия двойной спирали десятилетия. Очень многих в течение этих лет смущало то, что ДНК должна раскручиваться при репликации. Неужели она крутится в клетке, словно тросик спидометра?

Разные люди относились к этому по-разному. Одним это не казалось странным. Другие отмахивались – мол, как-нибудь все уладится. Третьи придумывали хитроумные объяснения. Один физик-теоретик, например, утверждал, что одна цепь может пройти сквозь другую путем квантового туннелирования. И наконец, были такие, кто усматривал в этом явный дефект модели Уотсона—Крика. Они настаивали на том, что по крайней мере в клетке ДНК – не двойная спираль.

По-видимому, правы были те, кто занял выжидательную позицию. Похоже, что топоизомеразы решают все подобные проблемы. Во всяком случае они способны создать в клетке такие условия, при которых цепи и впрямь как бы туннелируют друг сквозь друга. Как все это происходит реально в клетке – еще предстоит выяснить. Пока ясно одно – основной аргумент критиков двойной спирали, которым они пользовались многие годы, потерял силу.

Таким образом, упорные попытки завязать ДНК в узел неожиданно привели к разрешению старых споров в отношении двойной спирали. И все же оставался вопрос о том, насколько количественно верны наши теоретические предсказания о вероятности заузливания ДНК. В 1993 году две группы, С. Шоу и Дж. Уонг в Гарварде и В. Рыбенков, Н. Коззарелли и А. Вологодский в Беркли, пришли к однозначному заключению на этот счет, исследуя замыкание молекул ДНК с липкими концами. Они изучали молекулы, значительно более короткие, чем ? ДНК, содержащие около 10 тысяч пар оснований, для которых узлы разного типа приводят к различию в подвижности в геле. Это дало возможность экспериментально измерить долю узлов разных типов, образующихся при замыкании молекул ДНК в результате слипания липких концов. Эта доля служила мерой вероятности образования узлов. Данные, независимо полученные двумя группами, количественно совпали и оказались в полном согласии с теоретическими предсказаниями.

И все-таки, как же быть с ДНК бактериофага l? Помните, с какого аргумента все началось? Если концы фаговой ДНК слипнутся и образуют кольцо, то с вероятностью около 50 % кольцо окажется заузленным. Могут ли топоизомеразы решить эту проблему? Казалось бы, нет. Ведь, будучи ферментами, т. е. биологическими катализаторами, топоизомеразы должны лишь ускорять протекание реакций, но не смещать равновесие между начальным и конечным продуктом в ту или иную сторону. Безусловно, когда образуются страшные напряжения при репликации ДНК, просто включение процесса прохождения цепи ДНК сквозь саму себя (что вообще не может произойти за любое сколько-нибудь разумное время без помощи топоизомераз) решает проблему. Но не то в случае с l ДНК. Ведь 50 %-ная вероятность заузливания отвечает теоретической, равновесной величине, которую топоизомераза, будучи ферментом, не может сдвинуть ни в ту, ни в другую сторону. Как же так? За что боролись?! Неужели надо искать еще какие-то механизмы, препятствующие образованию узлов?

Оказывается, что не надо. Как выяснилось, топоизомераза II ведет себя более чем странным образом. Она активно развязывает узлы, вместо того чтобы приводить ДНК к равновесию в отношении ее топологии. Точно так же топоизомераза II расцепляет катенаны, состоящие из двух молекул ДНК. Что за чертовщина? Постойте, какой же тогда это катализатор?!

Конечно, никакой чертовщины в таком поведении топоизомеразы нет. Ведь при своей работе топоизомеразы II потребляют энергию АТФ. Более того, уже давно известно, что первый из открытых ферментов этого типа, ДНК-гираза, уводит зкДНК от равновесного, релаксированного состояния, делая ее отрицательно сверхспирализованной. Все это означает, что топоизомераза II (таки да!) – никакой не биологический катализатор, а молекулярный мотор, запрограммированный упрощать топологию в случае возникновения узлов и зацеплений. В этом есть очевидный биологический смысл – так клетка решает все свои топологические проблемы. Вообще, мы напичканы молекулярными моторами, а вовсе не только ферментами. Иначе на что бы мы были способны? Пальцем пошевелить бы не могли. Другой вопрос: как же на самом деле наш топологический мотор работает? Как топоизомеразам удается развязывать узлы? Ведь топология – это глобальная характеристика замкнутой в кольцо ДНК, размеры которой гораздо больше размеров белка-мотора. Это интереснейший вопрос, который недавно удалось разрешить, но мы не будем здесь на этом останавливаться – в двух словах не объяснишь, а длинное объяснение уведет нас слишком далеко.