Книга: Гены и развитие организма

3. Генная инженерия

3. Генная инженерия

Этим термином называют различные методы, в основе которых лежит синтез различных ДНК invitro, их размножение в бактериальных клетках и затем использование для выяснения структуры и функции генов. Для методов генной инженерии используют ферменты, полученные из бактерий или клеток, зараженных вирусами. Среди них набор рестриктаз — ферментов, разрезающих ДНК в совершенно определенных точках. Для каждой рестриктазы (их сейчас известно более 70) характерна своя определенная последовательность из четырех-шести пар нуклеотидов ДНК, которую фермент «опознает» и выбирает для своего действия.

Решающую роль в генной инженерии играет особый вирусный фермент, который называется «обратная транскриптаза». С его помощью осуществляется синтез ДНКна РНК. Это позволяет как бы синтезировать гены, точнее, получать точную ДНКовую копию всех или одного вида РНК. Этот «ген» не будет настоящим уже потому, чтов нем не будет копий интронных участков, которые не попадают в состав мРНК.

Наконец, существует возможность «встроить» готовую ДНК — синтезированный ген (копию мРНК) — в особую кольцевую ДНК-плазмиду, способную автономно размножаться в бактериальных клетках. Это позволяет получить нужный нам вид ДНК практически в неограниченном количестве.

Размножение бактерий, содержащих введенную Плазмиду, позволяет получить «библиотеку» генов. Если ДНК, выделенную из клеток, разрезать на части, встроить в плазмиду, ввести в бактерии и их выращивать, то в культуре будут расти бактерии, в принципе содержащие все районы ДНК, т. е. все гены. Из такой культуры можно выделить по одной бактерии и из каждой выращивать отдельный клон бактерий вместе с плазмидами и вставленными в них ДНК животного. В каждом таком клоне будет содержаться только один отрезок ДНК животного, ведь бактерия — родоначальница клона была заражена только одной плазмидой с одной встроенной в нее молекулой (отрезком) ДНК. Если размеры такого отрезка ДНК невелики, то он будет содержать не более одного-двух генов. Размножая бактерии одного клона, можно выделять из них любые количества совершенно одинаковых отрезков ДНК. Часто это будут отдельные гены с окружающими их районами. Вырастив из одиночных бактерий сотни или тысячи разных клонов, можно таким путем получить большой набор отдельных генов, разделенных по разным клонам. Это и есть «библиотека» генов.

В принципе в такой «библиотеке» содержатся все гены, отделенные друг от друга и многократно размноженные, т. е. клонированные. Однако найти в такой «библиотеке» нужный ген не так просто, Для этого используют такие клетки животных, где этот ген активно работает. Для генов глобина это будущие эритроциты — эритробласты, длягена овальбумина это клетки яйцевода кур. Из таких клеток получают мРНК, а из них пытаются выделить в чистомвиде один вид мРНК, например глобиновую. Имея такую мРНК, можно путем гибридизации проверить все клоныДНК и, если удастся, найти тот, в котором окажется нужный нам ген. Далее уже клон бактерий, содержащий этотген, будет постоянным его источником.

Используя эти сложные и трудоемкие методы, мы получили такие данные, которые вполне оправдали все усилия. Были, например, изучены гены глобина, овальбумина и десятки других и установлено их сложное строение с чередованием экзонов, кодирующих часть полипептидной цепи, и интропов, не несущих информации о белке. Очень немногие гены не содержали интронов, часто их было от двух до семи, но иногда попадались гены, расколотые на десятки экзонов, отделенных друг от друга нитронами. Смысл этого пока непонятен.

Часть генов была секвенирована, т. е. в них была определена последовательность нуклеотидов как в самом гене, так и в непосредственной близости от него. Наконец, некоторые гены (5SРНК и гены гистонов) были подвергнуты «хирургическим операциям»: от них отрезали кусочки различной длины и после этого проверяли, сохранил ли такой ген способность к быстрой и правильной транскрипции. Это позволило выявить вблизи гена или в нем самом регуляторные участки.

Имея клонированные и идентифицированные гены, можно исследовать не только их строение, но и функцию в клетке. Так, их можно, например, гибридизировать с политенными хромосомами дрозофилы и установить локализацию отдельных генов. Их можно гибридизировать с РНК из различных клеток или из разных стадий развития. Такой метод очень чувствителен и позволяет обнаружить такие РНК, которые содержатся в количестве одной-двух молекул на клетку. С помощью этих методов можно оцепить, сколько видов РНК синтезируется в клетке и в каком количестве копий представлены эти виды. Можно также выявить, сколько копий, в какой ткани и на какой стадии развития содержит клетка отдельных конкретных (индивидуальных) мРНК. Работа во всех этих направлениях ведется сейчас в десятках лабораторий мира, но возможности таких исследований еще далеко не исчерпаны.