Книга: Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Она плавится, но не так, как лед

<<< Назад
Вперед >>>

Она плавится, но не так, как лед

И все-таки те, кто ждал от молекулы ДНК необычных физических свойств, были вознаграждены. Одномерность и апериодичность кристалла ДНК в полной мере проявляются при его плавлении. Но если кристаллическое состояние ДНК – это понятно, что такое, то как представить его переход в жидкое? Во что может превратиться одномерный кристалл ДНК при плавлении?

Чтобы разобраться в этом, вспомним, почему плавится лед. Лед представляет собой кристалл, построенный из молекул Н2О. В нем царит строгий порядок, при котором молекулы воды связаны друг с другом максимально возможным числом так называемых водородных связей (Н-связей): HO-H … OH2. Это те самые Н-связи, которые образуются в комплементарных парах оснований А•Т и Г•Ц (см. главу 9). Некоторые из этих связей рвутся, другие деформируются при переходе воды в жидкое состояние. Что же заставляет воду быть жидкой при температуре выше нуля по Цельсию? Потеряв часть из связей, ослабив другие, молекулы воды приобретают возможность гораздо свободнее двигаться (перемещаться и вращаться), что становится очень выгодным с ростом температуры. При еще большем нагревании молекулы воды ради полной свободы жертвуют последними связями друг с другом – происходит переход из жидкого в газообразное состояние. Это общая тенденция. С ростом температуры вещества проявляют готовность пожертвовать энергией связи между молекулами ради увеличения энтропии.

Все это в полной мере относится и к ДНК – с ростом температуры существование двойной спирали становится невыгодным. Межмолекулярные связи, Н-связи внутри пар оснований и так называемые стэкинг-взаимодействия между соседними вдоль цепи парами, удерживающие две комплементарные цепи друг около друга, рвутся, и из одной двунитевой молекулы образуется две однонитевые цепи (рис. 11). Энтропийно (т. е. в смысле получения большей свободы) это выгодно потому, что, не будучи связанной с комплементарным партнером, каждая цепь чувствует себя гораздо свободнее, может приобретать намного больше различных конфигураций в пространстве.

Сами нити ДНК порвать простым нагреванием нельзя – связи, соединяющие нуклеотиды в цепочку, настолько прочны, что их можно разрушить либо сильной кислотой, либо порезать ферментами нуклеазами.

Несмотря на аналогию, плавление ДНК принципиально отличается от плавления льда. Отличие состоит в том, что плавление ДНК происходит в широком интервале температур; этот интервал равен нескольким градусам, а плавление льда происходит строго в одной точке на шкале температур. Это так называемый фазовый переход. При таком переходе скачкообразно изменяется фазовое состояние вещества – из твердого оно становится жидким, из жидкого – газообразным.


Рис. 11. Так плавится ДНК

Мы каждый день сталкиваемся с фазовым переходом, когда кипятим чайник. В процессе кипения система вода—пар находится в самой точке фазового перехода – температура чайника ни на йоту не превысит 100 °C, пока не выкипит вся вода. То же самое будет происходить при нагревании льда или снега. Температура растет до 0 °C, потом рост прекратится, пока весь лед полностью не растает, а затем температура вновь пойдет вверх.

В отличие от фазовых систем, у ДНК температура растет непрерывно, и с ее повышением все новые участки молекул переходят из спирального состояния в расплавленное. Интересно, что это отличие – прямое следствие одномерности кристалла ДНК.

Осознавать, что такое поведение вещества возможно, физики начали еще до Второй мировой войны, когда и не думали о ДНК или о реальных одномерных кристаллах. Просто никак не удавалось построить полную теорию фазовых переходов в настоящих трехмерных кристаллах (это получилось лишь гораздо позже – в 1970-х годах), и возникла мысль, что, может быть, удастся это сделать хотя бы для одномерного или двумерного кристалла. Проанализировать первый вариант оказалось совсем просто. Но вот беда – никакого фазового перехода не получалось. Глубокий смысл этой неудачи был понят знаменитым советским физиком Львом Давидовичем Ландау (мы уже упоминали его имя в начале главы 2). Вот что он писал (вместе с Е. М. Лифшицем) в 1938 году: «Во всякой одномерной системе не может существовать фаз, так как они стремились бы перемешиваться друг с другом». Это утверждение, известное во всем мире как «теорема Ландау», долгое время считалось чисто негативным, означающим только, что одномерная система – никуда не годная модель для теоретического рассмотрения проблемы фазовых переходов.

Вряд ли Ландау думал, что когда-нибудь найдутся реальные системы, к которым удастся применить его утверждение. Но ДНК – это действительно почти такая система. Слово «почти» здесь поставлено потому, что теорема Ландау была доказана для строго однородных систем, а ДНК, как мы помним, – апериодический кристалл. Его составляют два сорта звеньев – пары А•Т и Г•Ц, отличающиеся силой связи. Пару А•Т легче порвать, чем пару Г•Ц. Поэтому ДНК, которая содержит больше пар А•Т, плавится при более низкой температуре.

Важно ли то, сколько типов пар – два или один, как в строго однородном кристалле? Да, важно. Это очень интересный вопрос, и его исследовали многие теоретики уже прямо в связи с проблемой плавления ДНК. Прежде всего следует отметить работы М. Азбеля, А. Веденова, А. Дыхне, Д. Крозерса, И. Лифшица, Э. Монтролла, Д. Поланда. Много занимался данной проблемой и автор этих строк.

Что же оказалось? Вывод, сделанный Л. Д. Ландау, остается в силе. И в апериодической ДНК фазового перехода быть не может. Принципиально это также объясняется одномерностью системы, но происходит по иной причине, чем в строго однородном кристалле. Фазы отсутствуют не потому, что они стремились бы перемешиваться, как говорил Ландау, а потому, что участки ДНК, обогащенные парами А•Т, плавятся при более низкой температуре, чем участки, обогащенные парами Г•Ц. Поэтому переход в новое состояние происходит с ростом температуры не скачком, а поэтапно, участок за участком.

Если мерить зависимость поглощения тепла от температуры для раствора молекул ДНК, то на графике, отражающем эту зависимость, вместо одного бесконечно узкого пика, который характерен для плавления льда, мы должны наблюдать множество пиков, отвечающих выплавлению отдельных участков в молекуле. Ширина каждого пика, как предсказывает теория, должна соответствовать примерно 0,5 °C. Эксперимент полностью подтвердил это предсказание. На рис. 12 видно, как идет поэтапное плавление ДНК (плазмиды Соl Е1), содержащей около 6500 пар оснований.

Конечно, никто не может измерить теплопоглощение одной-единственной молекулы. Экспериментатор обычно имеет дело с образцом, состоящим из миллиардов и миллиардов молекул, но у всех у них строго одинаковая последовательность нуклеотидов. И при той или иной температуре во всех молекулах раскрываются одни и те же участки. Поэтому, исследуя эффект на множестве одинаковых молекул, можно судить о том, что происходит с каждой из них в отдельности.


Рис. 12. Зависимость теплопоглощения ДНК от температуры. Такую кривую часто называют также дифференциальной кривой плавления. Приведенная кривая получена для ДНК, носящей кодовое название Соl Е1 и содержащей около 6500 пар нуклеотидов

Сотрудникам Института молекулярной генетики РАН в Москве (А. Боровик с соавторами) удалось буквально воочию наблюдать поэтапное плавление ДНК. Они научились фиксировать раскрытые участки в молекуле с помощью специально подобранного химического агента. Обработанные препараты изучались под электронным микроскопом. Опыт шел так. Раствор ДНК нагревали до определенной температуры, попадающей в интервал плавления. При этом раскрывались отдельные участки молекулы (цепи в этих местах расходились, и азотистые основания оказывались торчащими наружу). Затем в раствор добавляли вещество, реагирующее с раскрытыми основаниями, но неспособное связываться с основаниями, запрятанными внутри двойной спирали. Когда реакция заканчивалась, образец охлаждали до комнатной температуры – прореагировавшие участки уже не могли вновь закрыться и образовать двойную спираль.


Рис. 13. Так выглядит ДНК Соl Е1 под электронным микроскопом после того, как ее состояние зафиксировали при температуре 72 °C. Ясно видны три раскрытых, расплавленных участка: два – на концах и один – в середине

Обработанные таким образом молекулы ДНК исследовали под электронным микроскопом. Один из полученных электронно-микроскопических снимков показан на рис. 13. Получив множество снимков молекул, раскрытых при разных температурах, построили результирующую картину (рис. 14). По горизонтальной оси здесь отложена координата пары оснований вдоль цепи ДНК. По вертикальной оси – вероятность того, что данная пара раскрыта, а по третьей оси – температура. Сравнение с кривой зависимости теплопоглощения от температуры (слева вверху на рис. 14) показывает, что каждому пику действительно соответствует выплавление определенного участка ДНК. Рисунок позволяет определить, какой вид имеет молекула ДНК при любой температуре в интервале плавления. Например, видно, что при 72 °C в молекуле должны быть расплавлены оба конца, а также участок, отстоящий от левого конца на 80 % общей длины молекулы. Это как раз отвечает снимку, приведенному на рис. 13. Отметим, что в ДНК вовсе не всегда плавление начинается с концов, как в данном случае. Просто у этой молекулы на обоих концах расположены участки, сильно обогащенные парами А•Т.


Рис. 14. Полная картина плавления ДНК Co1E1, полученная путем компьютерной обработки большого числа электронно-микроскопических снимков типа приведенного на рис. 13

Да, изучать плавление ДНК оказалось гораздо более интересным делом, чем плавить лед. Вместо одного пика, у которого ширину-то не измерить, – множество пиков, положение и ширина которых определяются последовательностью нуклеотидов в ДНК. Каждая молекула ДНК имеет свой, характерный «профиль» плавления, в зависимости от хранящейся в ней генетической информации.

Но плавление ДНК – это не просто уникальное физическое явление. Это процесс, который постоянно происходит в клетке. В самом деле, и при удвоении ДНК, и при считывании с нее информации комплементарные цепи должны быть разведены, чтобы на каждой из них (в случае репликации) или на одной из них (в случае транскрипции) начался синтез цепей ДНК или РНК.

Как же разводятся цепи? Что играет роль утюга, способного расплавить участок ДНК? Эту роль играют специальные ферменты, в частности РНК-полимераза. Фермент прочно связывается с ДНК и расплетает ее, но не любой участок молекулы, а определенную последовательность нуклеотидов, промотор, расположенную между генами. После того как РНК-полимераза связалась с промотором и расплавила его (раскрывается около десяти нуклеотидов), она начинает двигаться вдоль гена, расплетая на своем пути все новые участки и ведя синтез молекулы мРНК. Те участки гена, с которых полимераза «съехала», вновь захлопываются, а синтезируемая молекула РНК свешивается в раствор. К ней подплывает рибосома и начинает синтез белка по законам генетического кода. Все это схематически показано на рис. 15.


Рис. 15. РНК-полимераза ползет по ДНК, синтезируя РНК. Рибосома считывает информацию с РНК, синтезируя белок, в соответствии с генетическим кодом

Способность комплементарных цепей ДНК разделяться и соединяться вновь нашла широчайшие применения в биотехнологии и генной инженерии. Хитроумные генные инженеры изобрели воистину чудодейственное устройство, осуществляющее полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Это устройство периодически нагревает и охлаждает образец ДНК. В результате осуществляется ПЦР, и одна исходная молекула ДНК амплифицируется («преумножается») в пробирке. Вы буквально можете начать с одной молекулы и после n циклов ПЦР получить в пробирке 2n молекул. Так таинство жизни, способность к воспроизведению, осуществляется в пробирке.

Но мы забежали вперед. Нам еще предстоит рассказать о рождении генной инженерии, заложившей основу биотехнологии, о ее потрясающих достижениях и захватывающих дух перспективах в последующих главах, в особенности в главе 10. А пока продолжим знакомство с самой молекулой ДНК.

<<< Назад
Вперед >>>

Генерация: 0.739. Запросов К БД/Cache: 3 / 1
Вверх Вниз