Книга: Что, если Ламарк прав? Иммуногенетика и эволюция

Чем гены антител отличаются от других генов: перестройки ДНК вариабельной области

Чем гены антител отличаются от других генов: перестройки ДНК вариабельной области

Принцип «ДНК делает РНК делает Белок», уже описанный в гл. 2, применим для всех организмов: от простых бактерий до сложньк позвоночных, включая человека. Однако существует одно важное отличие структуры генов высших клеток, включая клетки позвоночных, и соответствующих генов бактерий. Кодирующие последовательности эукариотических генов (экзо-ны) перемежаются с некодирующими участками ДНК (интронами).

В конце 1970-х годов Р. Роберте (Roberts) и П. Шарп (Sharp), получившие Нобелевскую премию в 1994 г., показали, что первичная копия информационной РНК (мРНК), образующаяся в клеточном ядре, содержит интронные последовательности, но к моменту выхода мРНК из ядра в цитоплазму, участки интронов в ней уже отсутствуют, а экзоны оказываются состыкованными, так что мРНК без запинки транслируется в белок.

Процесс удаления интронов называется сплайсингом РНК. Сплайсинг чрезвычайно точен, он редко разрезает РНК в неправильном месте. Сейчас известно, что для обозначения границ интронов существует сигнальная последовательность, узнаваемая особым ферментным комплексом (сплайсосомой). Некоторые интроны являются рибозимами (РНК-ферментами), способными к самосплайсингу. Возможно, это реликты «мира РНК», существовавшего много миллиардов лет назад. Часто сплайсосомы состоят из РНК и белка. Отметим один очень важный момент: места сшивок (разрезании), которые закодированы в ДНК-последовательности, разрезаются сплайсо-сомами, действующими на одноцепочечные последовательности РНК, только после транскрипции. Двухцепочечная ДНК генома никогда не разрезается в этих местах. Все гены, представленные одной копией (рис. 4.4), кодируют белки, необходимые для выполнения функций «домашнего хозяйства» клетки или многоклеточного организма. Именно эти гены являются предметом решения «жизнь или смерть» при дарвиновском отборе. Например, гены, кодирующие белковые субъединицы молекулы гемоглобина (которая переносит кислород от легких ко всем органам тела), представлены одной копией. Поврежденные молекулы, появившиеся в результате мутаций, обычно неэффективно переносят кислород и, следовательно, приводят к гибели организма или снижают его жизнеспособность.

Таким образом, в высших клетках имеется механизм редактирования РНК, который работает до того, как она появится в форме зрелой молекулы, кодирующей специфическую последовательность аминокислот — белок. Удаление интронов из РНК и соединение кодирующих последовательностей должны быть очень точными, чтобы гарантировать сохранение рамки считывания триплетов оснований (см. приложение). Если на этом этапе произойдет ошибка (и изредка они происходят), может образоваться мРНК с последовательностью «вне рамки». Обычно это приводит к синтезу ненормального белка и преждевременному прекращению синтеза из-за появления стоп-ко-дона. (Стоп-кодоны не определяют никакой аминокислоты. Таким образом, они прекращают добавление аминокислот к белковой цепи. Существует три стоп-кодона — это UAG,UAA и UGA.) Эти стоп-кодоны в норме определяют 3'-конец, или правую границу кодирующей последовательности гена. Преждевременная остановка (терминация) приводит к образованию более короткого белка, обычно со сниженной функцией. Следовательно, нормальные гены, кодирующие белки, можно представить как ряд соприкасающихся триплетных кодонов со стоп-кодоном на конце (подобно точке в конце предложения). Их называют открытой рамкой считывания (сокращенно ORF). Давление естественного отбора должно действовать против любой мутации, приводящей к появлению стоп-кодона внутри ORF.

Рис. 4.4. Строение бактериального гена и однокопийного эукариотического гена. На рисунке показаны различия в строении генов, кодирующих белок, у бактерий и у высших клеток. Обратите внимание, что левый конец цепи ДНК принято обозначать как 5'-конец, правый конец — как 3' (произносится как «пять штрих» и «три штрих», соответственно). Слово «однокопий-ный» означает, что в хромосоме находится только одна функциональная копия гена (в отличие от семейства V-генов, рис. 4.5, к которому относится много генов с очень высокой степенью сходства ДНК-последовательностей, расположенных в одной хромосоме). Участки ДНК, которые кодируют белок, изображены в виде прямоугольников. Двухцепочечная ДНК изображается прямой линией, одноцепочечная информационная мРНК — волнистой линией. Изогнутые стрелки указывают на точку начала транскрипции мРНК.

А.У бактерий участок, кодирующий белок, представлен непрерывной рядом триплетных кодонов, каждый из которых определяет одну аминокислоту (см. приложение). мРНК транскрибируется и немедленно транслируется в аминокислотную последовательность (белок) в рибосомах.

Б. У эукариот почти все гены, кодирующие белки, устроены сложнее. У них последовательности, кодирующие белок (экзоны), прерываются некодирующими последовательностями (интронами). На рисунке это обозначено промежутками между кодирующими участками. Редким исключением (гены без интронов) в высших клетках являются гены, кодирующие гистоны (табл. 5.1), а также псевдогены и функциональные ре-трогены, появившиеся в результате обратной транскрипции молекулы мРНК (см. гл. 7). Таким образом, по матрице ДНК создается длинная содержащая интроны молекула про-мРНК. Особая молекулярная внутриядерная органелла (сплайсосома) определяет границы между интронами и экзонами, вырезает интроны из про-мРНК и точно соединяет экзоны, образуя непрерывный кодирующий участок. Затем зрелая, или «процессированная», мРНК экспортируется из ядра в цитоплазму, где она транслируется в последовательность аминокислот в рибосоме.

Молекулярно-генетические исследования Ig-генов начались в середине 1960-х гг. К этому моменту было известно, что и тяжелые (Н), и легкие (L) цепи антитела выполняют двойственную функцию (рис. 3.2). Они состоят из вариабельной аминокислотной последовательности, или V-домена (служит для связывания антигена), и константной, или С -домена (служит, например, для запуска лизиса клетки-мишени или фагоцитоза). Гены антител отличаются от всех остальных генов, локализованных и картированных генетиками в определенных местах хромосом (называемых локусами). Гены, кодирующие V-и С-домены, отделены друг от друга огромным участком последовательности ДНК. Например, V- и С-домены тяжелых цепей мыши находятся в хромосоме 12, около концевого участка длинного плеча хромосомы. Генетическое картирование и последующее изучение последовательности нуклеотидов ясно показали, что V-участок отстоит от С-участка по крайней мере на 300 000 п. н. (300 тыс. п. н.) оснований! Почему?

Даже в середине 1970-х гг., когда стала известна экзоно-ин-тронная структура генов, такое большое расстояние казалось необычным. Однако десятью годами раньше Драйер (Dreyer) и Беннет (Bennet) предположили, что единый участок ДНК, кодирующий Н- или L-цепь, образуется в результате перемещения (транслокации) V-участка к С-участку. То есть, для объяснения удивительного свойства Ig-генов было предсказано существование особого типа редактирования, или сплайсинга ДНК-последовательностей. Далее, эти авторы допускали, что данный процесс происходит при созревании лимфоцита. Драй-ер и Беннет предположили, что часть Ig-локуса (или места локализации в хромосоме последовательности ДНК, кодирующей Ig-гены) содержит в зародышевой линии большое число (сотни) V-генов. В каждой отдельной В-клетке один из этих генов передвигается и становится рядом с одним из нескольких возможных С-генов. Случайное перемещение только одного V-ге-на из большого числа возможных приводит к тому, что клетка производит антитела только одной специфичности. После такой случайной перестройки генов Н- и L-цепей клетка из большого числа возможных комбинаций Н + L белковых цепей создает один полный белок. Затем клетка экспрессирует это антитело на поверхности, и ее судьба решается окончательно: если она окажется «против своих», она будет уничтожена. Если она выжила, она станет потенциальным участником иммунного ответа на чужие антигены.

Это теоретически привлекательное, хотя и достаточно смелое предсказание перестройки ДНК, было доказано лишь десять лет спустя Сусуми Тонегава, который описал организацию и перестройку генов Ig-локуса у мыши[3]. Оказалось, что перестройка ДНК много сложнее, чем предполагалось. Этот процесс изображен на рис. 4.5; он имеет место и у мыши, и у человека. У других позвоночных может быть несколько иная, но в принципе сходная организация кодирующих элементов Ig-локуса.

Несмотря на то, что до точного картирования и секвениро-вания (определения последовательности нуклеотидов) каждого V-элемента генома мыши и человека еще далеко, у нас есть четкая картина строения Ig-генов в клетках зародышевой линии и в соматических клетках. На рис 4.5 приведена схема строения гена тяжелой цепи Ig, но очень похожие схемы можно нарисовать и для генов легких цепей Ig, и для ТкР-генов. Обратите внимание, что около ста V-генов (или V-элементов) расположено левее соединительных J-элементов (от англ. joining — J) и D-элементов (от англ. diversity — разнообразие), а они, в свою очередь, отделены от небольшого числа (примерно 8) генов константной области (C-constant). D- и J-элементы кодируют от трех до пятнадцати аминокислот, тогда как V-элемент — около 100 аминокислот.

О генах антител в неперестроенном виде говорят, что они имеют «конфигурацию зародышевой линии». В таком виде находится ДНК в половых клетках (сперматозоидах и яйцеклетках) и во всех клетках организма, кроме зрелых лимфоцитов (в клетках печени, почек, поджелудочной железы, в других лимфоцитах, например, в фагоцитах). В каждом созревающем лимфоците мыши и человека ДНК подвергается случайной соматической перестройке. Один из V-элементов перемещается и соединяется с одним D- и одним J-элементом. Этот участок располагается перед первым С-геном. Кодирующий С-участок разделен рядом интронов. После этого все еще остается длинная промежуточная последовательность между перестроенным V-геном, который теперь называется V(D)J-ген, и С-участком. Эту структуру называют «соматической конфигурацией». Скобки вокруг D в общем символе гена появляются, потому что гены легких цепей Ig построены только из V- и J-элементов.

В конфигурации зародышевой линии ДНК не транскрибируется в мРНК, по которой могли бы синтезироваться Н- или L- белковые цепочки антитела. В соматической конфигурации перестроенные V(D)J- и С-участки активно транскрибируются, образуется мРНК, которая транслируется в Н- и L- цепи антитела. В неперестроенных V-элементах никогда не происходит соматического мутирования. Мутации появляются только в V(D)J-перестройке.

Перестройки ДНК выполняются набором особых рекомби-национных ферментов. Кодирующие их гены называются генами, активирующими рекомбинацию (recombination activating genes — RAG), и локализованы где-то в других местах генома. RAG-ферменты распознают ДНК-последовательности (реком-бинационные сигнальные последовательности) на соответствующих концах V-, D- и J-элементов, которые и соединяются. Первым шагом в экспрессии тяжелой цепи в созревающей В-клетке костного мозга человека или мыши является DJ-пере-стройка. Вся промежуточная ДНК между D-элементом (их может быть 20 или более) и J-элементом (их 4 или 5) удаляется. Следующий шаг — перемещение случайно выбранного V-эле-мента к перестроенному DJ-элементу, причем снова вся промежуточная ДНК удаляется.

Рис. 4.5. Строение генов, кодирующих V- и С-области тяжелых цепей антитела, в зародышевой линии и после соматической перестройки у человека и мыши.

А.В конфигурации зародышевой линии ряд очень похожих (но все-таки различных) вариабельных V-элементов лежит выше (левее) экзонов, кодирующих константную С-область. Эти V-элементы зародышевой линии (кодирующие примерно 95 аминокислот) называются неперестроенными. Между V- и С- элементами расположены D- и J-элементы (каждый кодирует короткую последовательность аминокислот). Каждый V-элемент имеет лидерную (L) последовательность, которая кодирует короткую последовательность аминокислот, сигнальный пептид. Все гены, кодирующие белки, например, антитела, предназначенные для выведения из клетки (для секреции) или для перехода в другие окруженные мембраной области клетки, имеют такие сигнальные пептиды, которые позволяют им перемещаться в нужные внутриклеточные или внеклеточные области. Интрон между L и V называется L-V-интроном (или лидерным интроном). Его значение для понимания следов интеграции сомы в зародышевую линию подробно описано в гл. 6.

Б. В ходе развития В-клеток в костном мозге в каждом В-лимфоците случайно перестраиваются V-, D- и J-элементы тяжелой цепи, и появляется перестроенная последовательность вариабельной области VDJ, которая теперь называется соматической конфигурацией. Для Н-цепей на первом этапе перестройки происходит объединение DJ, за ним следует объединение с V-элементом, и образование VDJ. После перестройки обнаруживается, что вся ДНК между случайно выбранным V-элементом и использованным J-элементом удаляется из клетки. Таким образом, каждая успешная перестройка ДНК вариабельной области уникальна для каждой зрелой В-клетки. Обратите внимание, что перестроенный участок (VDJ) лежит выше (левее) экзона, кодирующего С-белок. Заметьте также, что в участке между VDJ и С, названном J-C-интроном, лежит неиспользованный элемент (который в этом примере просто удаляется). Про-мРНК, содержащая вариабельный (VDJ) участок, присоединенный к С-участку, образуется в ядре. L-V и J-C интроны (и интроны внутри С -участка) затем вырезаются, что приводит к экспорту зрелой РНК молекулы в цитоплазму, где она транслируется на рибосоме в последовательность аминокислот. Лидерный (сигнальный) пептид отрезается от белка, когда он выделяется из клетки (объяснения терминов см. также в табл. 3.1 и 5.1, на рис. 4.4 и в тексте). Соматическая конфигурация и конфигурация зародышевой линии генов L-цепей такая же, кроме того, что легкие цепи не содержат D-участков.

Продемонстрированные Тонегавой V(D)J-nepecтройки (случайное использование примерно 100 V-генов, 20 D-генов и 4 J-генов и случайное объединение тяжелых и легких цепей для образования гетеродимерного связывающего центра) дают возможность продуцировать большое потенциальное разнообразие белков из сравнительно небольшого количества генетического материала. Кроме того, иногда слияние V, D, и J приводит к добавлению или потере оснований, увеличивая, таким образом, разнообразие.

Разобравшись в этих молекулярных процессах, мы можем теперь задать два очень важных вопроса. Почему В-лимфоцит производит антитела только одной специфичности? Почему соматические мутации (в В-лимфоцитах) возникают преимущественно в перестроенном V(D)J-участке?

Все соматические клетки (клетки тела) имеют двойной набор хромосом, один набор от матери, другой от отца. Такие клетки называются диплоидными. Сперматозоиды и яйцеклетки имеют только по одному набору хромосом (они гаплоидны). Оплодотворение, слияние сперматозоида и яйцеклетки, восстанавливает диплоидное состояние. Кроме половых хромосом (X и Y), все другие хромосомы диплоидного набора разбиваются на пары с очень похожими ДНК-последовательностями. По мере созревания В-лимфоцита начинается перестройка V-, D- и J-элементов. Успешная V(D)J-перестройка в одной хромосоме посылает сигнал, который выключает активность RAG-ферментов и препятствует перестройке в гомологичной хромосоме. Вот, в принципе, ответ на первый вопрос. Дальнейшие детали мы не рассматриваем.

Второй вопрос, почему мутации ограничиваются V(D)J-участком, чрезвычайно важен для обсуждения обратной связи между сомой и зародышевой линией, которая составляет главную тему этой книги. Мы подробно расскажем об этом в следующей главе. Здесь подчеркнем лишь некоторые общие принципы. Если мутации в вариабельной области антитела могут оказаться полезными, то мутации в константной области, скорее всего, вредны, так как они могут нарушить эффекторные функции антитела, запуск лизиса бактериальных клеток или стимулирование фагоцитоза (рис. 3.1). Разделение V- и С-участков позволило эволюции создать механизм, который обеспечивает мутации в V-участке, но сохраняет С-участок неизменным. Вот что происходит в В-лимфоците на определенных стадиях его жизни. Перестроенный V(D)J-ген может подвергаться очень высокому уровню соматических мутаций, и новое антитело оценивается по способности связывать антиген (см. следующую главу). Антитела с самой высокой аффинностью к чужеродному антигену выигрывают в отборочных соревнованиях за связывание антигена, сохраняются и становятся долго живущими клетками памяти. В-лимфоцит проиграет соревнование, если мутация уменьшает или уничтожает аффинность; такие клетки погибают. В-лимфоциты, кодирующие антитела, которые связывают собственные антигены, также уничтожаются, и, следовательно, сохраняется аутотолерантность.

Сейчас мы хорошо понимаем, как иммунная система может кодировать миллионы специфических антител, и что тем не менее все еще имеется достаточно ДНК для всех остальных генов, необходимых клетке и многоклеточному организму. Простыми вычислениями можно показать возможности зародышевой линии:

• у мыши или человека в конфигурации зародышевой линии Н-цепи закодировано примерно 100 V-элементов, примерно 20 D-элементов и 4 J-элемента. В соответствии с моделью случайных перестроек это может дать 100 х 20 х 4 = 8000 возможных Н-белковых цепей;

• конфигурация зародышевой линии главного генного кластера, определяющего L-цепь, кодирует примерно 100 V-элементов и 4 J-элемента, что может дать 100 х 4 = 400 возможных L-белковых цепей;

• таким образом, общее число возможных HL-белковых гете-родимеров, при условии, что все Н + L образуют жизнеспособные антитела, равно 8000 х 400 = 3,2 х 10⁶, или примерно 3 миллиона специфичных антител.

В этих вычислениях не учитывается дополнительное разнообразие, возникающее в результате добавлений или потерь оснований в процессе слияния V(D)J.

Сколько же из этих 3 млн. потенциальных антител используется? Ответ прост — мы не знаем. Однако нам известно, что около половины V-элементов никогда не участвуют в образовании антитела (то есть обнаружено, что они не перестраивались в В-клетках). Род Лангман (Langman) и Мелвин Кон теоретически рассмотрели один фактор, который ограничивает репертуар антител. У мыши примерно 50 миллионов В-клеток. Если случайный репертуар из 3 млн. антител разных специфичностей равномерно распределен по 50 миллионам В-клеток, то среднее число клеток с данным антителом должно быть равно примерно семнадцати. При острой бактериальной инфекции для того чтобы победить в суровой борьбе с быстро размножающимися бактериями, иммунная система должна выработать большое количество антител с достаточной авидностью, чтобы уничтожать больше бактерий, чем их образуется при размножении. Так как бактерии могут делиться чаще, чем один раз в час, а В-клетки затрачивают по крайней мере 5—6 часов на деление, это соревнование может быть выиграно только при условии, что начальное число В-клеток, связывающих эти бактерии, велико. Другие критические факторы — это скорость образования белка антитела в В-клетках и их физическая локализация относительно места инфекции. Чем ближе они находятся, тем выше локальная концентрация антител и больше скорость уничтожения инфекции. Эти ограничения заставили Лангмана и Кона предположить, что начальный репертуар функциональных антител (до соматического мутирования) должен быть меньше потенциального репертуара. Они полагают, что разнообразие у мышей — около 10 тыс. специфичностей, что дает в среднем по 5 тыс. В-клеток на специфичность.

Однако эти оценки размера репертуара антител все еще велики. Основа стратегии иммунной системы как мыши, так и человека — это случайные перестройки V- , D- и J-генов. Полностью функциональные белки антител закодированы в зародышевой линии как отдельные участки ДНК, «ожидающие» соматической перестройки и сборки в функциональный V(D)J-ген (рис. 4.5). Затем случайная комбинация Н- и L-белковых цепочек образует HL-гетеродимер — антитело. Такая стратегия хранения генетической информации чрезвычайно экономна и позволяет зашифровать миллионы потенциально полезных вариантов.

Дополнительное соматическое варьирование перестроенных V(D)J-последовательностей в В-лимфоцитах также вносит вклад в разнообразие репертуара благодаря селективному размножению антител отдельных специфичностей. Действительно, сейчас мы знаем, что в зрелых В-клетках возникают вызванные антигеном соматические гипермутации перестроенных V(D)J-участков. Это важно, так как дает возможность отобрать и размножить мутантные В-клетки, производящие антитела высокой аффинности. Существует также явление, описанное группой ученых под руководством Мартина Уайгерта (Weigert) и другими, называемое «замещение V-гена» [5]. Оно происходит при образовании тяжелых цепей, и суть его состоит в том, что находящийся выше V-элемент может занять место уже существующего элемента в VDJ-последовательности. Во время клонального роста одна и та же линия В-клеток может подвергаться нескольким последовательным заменам V-гена.

Еще один момент, который следовало бы повторить, говоря о процессе перестройки и объединения V(D)J, заключается в том, что полный ген, кодирующий вариабельную область антитела, собирается из нескольких частей (битов) ДНК-последовательностей. Несколько членов каждого семейства этих частей (V, D и J) собираются случайно. V-D-J объединенный участок формирует связывающий центр антитела, который находится в непосредственном контакте с молекулой антигена.

Известно два исключения из этого общего правила, гласящего: что ни одного полного V-гена не существует в ДНК зародышевой линии. У скатов (хрящевые рыбы) одно семейство генов L-цепи в зародышевой линии состоит из «слитых» VJ-по-следовательностей [б]. Либо это семейство представляет собой первичный ген, который существовал до разделения V- и J-элементов, либо оно возникло в результате объединения V- и J-элементов. Группа Гэри Литмана (Litman), обнаружившая эти гены, отдает предпочтение последней интерпретации. Второе исключение — это группа V-псевдогенов тяжелых цепей у кур, которые содержат и «частички D», присоединенные к концу V-последовательности в предпочтительной рамке считывания, существующей в функциональных VDJ-перестройках [7]. Возможно, эти гены появились благодаря обратной транскрипции мРНК, кодирующей V(D)J-o6nacTb, в результате чего возникли ретротранскрипты кДНК с рамкой считывания объединенных VJ или VDJ, которые каким-то образом включились в половые клетки.

Мы подробно обсуждаем детали строения локусов Ig в конфигурации зародышевой линии и соматической конфигурации, поскольку это позволит интерпретировать их в рамках предположения о существовании ламарковского процесса обратной связи сомы и зародышевой линии. В следующих главах мы сравним эти конфигурации и увидим, что различия между ними высвечивают генетическую уникальность иммунной системы и позволяют назвать «умными» гены, кодирующие антитела и ТкР. Уникальные свойства Ig-генов и молекулярных продуктов этих генов, созданные в ходе эволюции позвоночных, дают возможность по-новому взглянуть на роль некоторых генетических процессов, протекающих в иммунной системе. К этим процессам относятся сплайсинг V(D)J-информационной РНК, обратная транскрипция и предполагаемый перенос ДНК от сомы в зародышевую линию.

Для многих читателей это утверждение может показаться непоследовательным. Действительно, если эволюция со всей своей мудростью смогла создать такую генетическую стратегию, которая способна кодировать более миллиона разных антител, достаточного для ответа на неожиданное, то нуждается

ли такая эффективная система в ламарковской обратной связи генов? Возможный ответ таков: дошедшая до наших дней система не могла появиться без соматического гипермутирования и без обратной связи генов сомы и зародышевой линии. Мы вернемся к этой проблеме позже.